紅泡刺藤不同部位總黃酮提取及其抗氧化性

宋志姣 李志強 李建珊 李悅 楊麗華 章金龍 李曉嬌

摘要：以紅泡刺藤葉片為材料，優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取總黃酮的提取工藝;在最優(yōu)提取條件下探討紅泡刺藤不同器官總黃酮含量和抗氧化性差異。通過正交試驗，確定了紅泡刺藤葉總黃酮最佳提取工藝：乙醇體積分數(shù)40%，料液比1∶30 （g/ml），超聲波提取功率175 W，超聲波提取時間45 min。在此條件下紅泡刺藤根、莖、葉和果實總黃酮含量分別為24.66 mg/g、19.06 mg/g、28.07 mg/g和4.05 mg/g。紅泡刺藤根、莖、葉和果實的總黃酮具有較強的抗氧化活性，對羥基自由基有很好的清除效果，其IC50值分別為1.620 mg/L、0.537 mg/L、3.655 mg/L和1.499 mg/L，清除能力排序為莖總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮>葉總黃酮;其DPPH自由基的IC50值分別為7.856 mg/L、3.559 mg/L、5.481 mg/L和5.574 mg/L，清除能力大小為莖總黃酮>葉總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮，抗氧化性均顯著高于VC。

關(guān)鍵詞：紅泡刺藤;總黃酮;提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號：S567.9文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0727-06

Extraction of total flavonoids from different parts of Rubus niveus and evaluation of antioxidant activity

SONG Zhi-jiao，LI Zhi-qiang，LI Jian-shan，LI Yue，YANG Li-hua，ZHANG Jin-long，LI Xiao-jiao

（College of Resources and Environmental Sciences， Baoshan University， Baoshan 678000， China）

Abstract：In this study， the leaves of Rubus niveus were used as test materials， and the extraction process of total flavonoids by ultrasound-assisted extraction（UAE） with ethanol was optimized. Herein， the comparison of the total flavonoids contents and antioxidant activities in different organs of R. niveus was carried out under the optimal conditions. Four factors （ethanol concentration， ratio of material to ethanol， ultrasonic power and extraction time） were evaluated to determine the optimal extraction conditions by using orthogonal design. The optimal extraction conditions were as follows： concentration of ethanol was 40%， material to ethanol ratio was 1∶30 （g/ml）， ultrasonic power was 175 W， and extraction time was 45 min. Under the optimal extraction conditions， the total flavonoids contents in roots， stems， leaves and fruits of R. niveus were 24.66 mg/g， 19.06 mg/g， 28.07 mg/g and 4.05 mg/g， respectively. The total flavonoids extracted from roots， stems， leaves and fruits showed strong antioxidant activity and high hydroxyl radical scavenging activity， and IC50 values were 1.620 mg/L， 0.537 mg/L， 3.655 mg/L and 1.499 mg/L， respectively. Thus， the hydroxyl radical scavenging abilities of extracts followed the order of stems>fruits>roots>leaves. In the DPPH free radical scavenging assay， the IC50 values of these organs were 7.856 mg/L， 3.559 mg/L， 5.481 mg/L and 5.574 mg/L. The DPPH free radical scavenging abilities of extracts followed the order of stems>leaves>fruits>roots. The results also showed that the antioxidant activities of total flavonoids in these different organs were significantly higher than VC.

Key words：Rubus niveus Thunb.;total flavonoids;extraction process;antioxidant activity

紅泡刺藤（Rubus niveus）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物[1]，是廣泛分布于中國西南各省的一個小規(guī)模栽培利用種，其果實營養(yǎng)價值豐富[2]。懸鉤子屬植物因富含黃酮類、萜類、酚酸類和甾體等生物活性成分，近年來成為研究熱點[3-5]。其中，總黃酮是2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央3個碳原子相互連接在一起的黃酮類化合物的總稱，是植物重要的次級代謝產(chǎn)物[6-7]。黃酮具有抗炎癥、抗過敏、抑制細菌、防治心腦血管疾病和抗腫瘤等功效[8-11]，在食品工業(yè)、代謝工程和醫(yī)藥方面均有大量應(yīng)用[12-14]。

懸鉤子屬植物總黃酮含量豐富：春、秋兩季山莓（Rubus corchorifolius）葉的總黃酮含量分別為1.46 mg/g和2.03 mg/g[15];刺萼懸鉤子（Rubus alexeterius）枝條的總黃酮含量為38.95 mg/g[16]。不同懸鉤子植物總黃酮的單體組成和含量不同：從提取自多腺懸鉤子（Rubus phoenicolasius）的總黃酮中分離得到了8種黃酮類單體成分[17];從掌葉復(fù)盆子（Rubus chingii）的粗提物中分離鑒定出18種化合物，包括7種黃酮類物質(zhì)[18]。然而，對于分布廣泛的紅泡刺藤，其研究和利用仍主要集中在果實品質(zhì)方面[19-20]，總黃酮提取和抗氧化性評價研究尚未見報道。

本研究以乙醇水溶液為提取劑，在超聲波輔助下以正交試驗優(yōu)化紅泡刺藤總黃酮提取工藝，在研究紅泡刺藤根、莖、葉、果實的總黃酮含量的同時比較不同部位粗提液的抗氧化活性，以期為紅泡刺藤綜合利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料與主要試劑

2018年6至7月在保山市施甸縣水長鄉(xiāng)（北緯24°55′35″，東經(jīng)99°04′41″，海拔1 590 m）采集紅泡刺藤根、莖、葉和果實。其中，根、莖、葉在45 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量后粉碎，過60目篩，密封保存;果實由于含水和含糖量較高，在-20 ℃條件下冷凍干燥至恒質(zhì)量后粉碎，過60目篩，密封存放于4 ℃冰箱。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine），由上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn);VC，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸和過氧化氫皆為分析純，試驗所用水均為去離子水。

1.2主要儀器及設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計由日本島津公司生產(chǎn)，SK250HP超聲儀由上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)，DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)D-1冷凍干燥機由北京德天佑科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，TDL-5-A離心機由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，CP214分析電子天平由奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋由常州國華電器有限公司生產(chǎn)。

1.3試驗方法

1.3.1總黃酮含量的測定以NaNO2-Al（NO3）3絡(luò)合分光光度法測定總黃酮含量。為了避免粗提液顏色干擾總黃酮測定，以不加NaNO2的待測液作為參比[21]。顯色劑用量參考梁愛軍[22]的方法。

1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用乙醇溶解并定容至25 ml，配制質(zhì)量濃度為400 μg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確量取0 ml、0.50 ml、1.00 ml、1.50 ml、2.00 ml、2.50 ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 ml容量瓶中，加0.3 ml 5%亞硝酸鈉溶液，5 min后加入0.3 ml 10%硝酸鋁溶液，5 min后加入3 ml 10%氫氧化鈉溶液并定容至刻度線，顯色40 min后取中間質(zhì)量濃度樣液和待測樣品溶液于200～780 nm掃描波長，以確定最佳吸收波長。在最佳吸收波長下測定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.3操作誤差考察分別準(zhǔn)確移取0.50 ml同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液6份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作步驟，分別在最大吸收波長下測定吸光度，考察操作誤差。

1.3.1.4儀器讀數(shù)誤差及最佳顯色時間考察準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 ml進行顯色反應(yīng)，分別在顯色10 min、25 min、40 min、55 min、70 min和85 min時測定其吸光度，每次測定讀數(shù)5次，考察儀器精密度，并確定最佳顯色時間。

1.3.2提取工藝優(yōu)化以干燥的紅泡刺藤葉片粉末為材料優(yōu)化總黃酮提取工藝。在單因素試驗確定因素水平的基礎(chǔ)上建立L9（34）正交試驗，因素和水平見表1。具體提取步驟為：準(zhǔn)確稱取紅泡刺藤葉片干樣1.000 0 g，按正交試驗設(shè)計表的參數(shù)提取紅泡刺藤葉片總黃酮，提取液抽濾后定容至100 ml。準(zhǔn)確移取5.00 ml粗提液按方法1.3.1.2進行顯色和測定，每因素3重復(fù)。

1.3.3紅泡刺藤各部位總黃酮的提取以最優(yōu)工藝分別提取紅泡刺藤根、莖和果實中的總黃酮并進行含量測定。

1.3.4抗氧化活性比較紅泡刺藤根、莖、葉和果實總黃酮對羥基自由基和DPPH自由基清除能力測定參考荊常亮[23]和熊雙麗等[24]的方法進行。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016繪制圖表，用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1總黃酮含量測定方法

于200～780 nm范圍內(nèi)對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液進行光譜掃描，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)溶液于509.5 nm波長處有較為平滑的吸收峰。因此，在509.5 nm波長下測定和繪制一元線性回歸方程：Y=0.011 2x-0.018 3，R2=0.999 7（圖1），說明黃酮類物質(zhì)在質(zhì)量濃度為0～120.00 μg/ml有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合較為理想，可以用來對總黃酮進行定量。

分別準(zhǔn)確移取0.50 ml蘆丁儲備液6份于10 ml容量瓶，經(jīng)顯色、測定和計算，得到RSD值為3.84%，表明試驗操作誤差較小。最佳顯色時間試驗結(jié)果表明，在40 min之前由于反應(yīng)尚未完全，吸光度隨著時間的增大而增大，在40 min之后有色物質(zhì)隨著時間的推移逐漸分解，吸光度逐漸減小，故以40 min為最佳顯色時間。精密度試驗結(jié)果表明UV-2600雙光束紫外-可見分光光度計精密度非常好，平均RSD僅為0.02%。說明試驗所用方法穩(wěn)定可靠，可以進行提取工藝優(yōu)化試驗。

2.2紅泡刺藤總黃酮提取工藝優(yōu)化

試驗結(jié)果表明最優(yōu)提取工藝條件為正交組合A2B1C3D2，而極差分析得出的最優(yōu)組合條件為A2B2C2D2（表2）。在相同條件下對A2B1C3D2和A2B2C2D2分別進行3次提取以驗證試驗結(jié)果，得到紅泡刺藤葉片總黃酮的提取率分別為2.81%和2.78%，無顯著差異。從節(jié)約提取劑、減少污染和避免浪費的角度建議以A2B1C3D2工藝進行總黃酮提取。因此，最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分數(shù)40%，料液比1∶30 （g/ml），超聲波提取功率175 W，超聲波提取時間45 min。

由極差分析和方差分析結(jié)果可知，在試驗因素和水平范圍內(nèi)，各因素對紅泡刺藤葉片總黃酮提取率影響的順序為D>A>C>B（表2、表3）。方差分析結(jié)果表明：超聲波提取功率和乙醇體積分數(shù)對提取率有顯著影響，料液比和超聲波提取時間對總黃酮提取率影響不顯著。理論最優(yōu)組合A2B2C2D2和試驗最優(yōu)組合A2B1C3D2 2個工藝，在2個顯著影響總黃酮提取率的參數(shù)上一致，也從側(cè)面說明了其余2個因素不顯著影響提取率。由此可知，在紅泡刺藤葉片總黃酮提取過程中，適宜的超聲波提取功率和乙醇體積分數(shù)是總黃酮提取的關(guān)鍵。

2.3紅泡刺藤根、莖、葉、果實總黃酮含量比較

以最優(yōu)工藝提取紅泡刺藤根、莖、葉、果實總黃酮。測定結(jié)果顯示，紅泡刺藤不同器官的總黃酮含量差異顯著（圖2），其中葉片總黃酮含量最高，為28.07 mg/g，根為24.66 mg/g，莖為19.06 mg/g，果實總黃酮含量最小為4.05 mg/g，約為葉片的1/7。因此，在以總黃酮為主的提取和應(yīng)用過程中，建議以紅泡刺藤葉片為原料。

乙醇體積分數(shù)欄中1、2、3分別表示乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%;料液比欄中1、2、3分別表示料液比為1∶30、1∶40、1∶50 （g/ml）;超聲波提取時間欄中1、2、3分別表示超聲波提取時間為25 min、35 min、45 min;超聲波提取功率欄中1、2、3分別表示超聲波提取功率為150 W、175 W、200 W。

不同字母表示不同器官總黃酮含量顯著差異（P<0.05）。

2.4紅泡刺藤總黃酮抗氧化活性

2.4.1總黃酮對羥基自由基的清除羥基自由基是一種重要的活性氧[25-26]，是氫氧根失去一個電子后形成的，羥基自由基可與水楊酸反應(yīng)生成紫色的2，3-二羥基苯甲酸[27]。羥基自由基的清除過程是電子轉(zhuǎn)移的過程，如果反應(yīng)體系中存在著像總黃酮這樣的抗氧化劑，總黃酮與羥基自由基反應(yīng)生成的產(chǎn)物無色，反應(yīng)體系吸光度下降?？寡趸瘎┑目寡趸芰υ綇姡磻?yīng)體系顏色越淺。對羥基自由基清除試驗中，在最大吸收波長525.5 nm下，紅泡刺藤根、莖、葉和果實總黃酮粗提液對羥基自由基清除能力都隨總黃酮質(zhì)量濃度增加而增大（圖3）。紅泡刺藤根、莖、葉、果實總黃酮及VC對羥基自由基清除的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50值）分別為1.620 mg/L、0.537 mg/L、3.655 mg/L、1.499 mg/L和40.776 mg/L，清除能力大小為莖總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮>葉總黃酮>VC。相同質(zhì)量濃度的紅泡刺藤根、莖、葉和果實總黃酮提取物的羥基自由基清除能力之間均存在極顯著差異（P<0.01）。

VC的質(zhì)量濃度為總黃酮質(zhì)量濃度的5倍。

2.4.2總黃酮對DPPH自由基的清除DPPH自由基在乙醇溶液中處于穩(wěn)定狀態(tài)，溶液有顏色。如果反應(yīng)體系中有可以提供H+的物質(zhì)存在，則DPPH自由基被還原為DPPH-H，溶液顏色減弱或消失[7，28]。對DPPH自由基清除試驗中，在520 nm最佳吸收波長下，紅泡刺藤根、莖、葉、果實乙醇粗提液清除DPPH自由基的能力都隨總黃酮質(zhì)量濃度增加而增大。通過計算得到紅泡刺藤根、莖、葉、果實總黃酮及VC對照對DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50值）分別為7.856 mg/L、3.559 mg/L、5.481 mg/L、5.574 mg/L和133.777 mg/L，清除能力大小為莖總黃酮>葉總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮>VC（圖4）。每個質(zhì)量濃度梯度中，紅泡刺藤各部位總黃酮的DPPH自由基清除能力均極顯著大于2倍質(zhì)量濃度的VC。

VC質(zhì)量濃度為總黃酮質(zhì)量濃度的2倍。

3討論

通過正交試驗得到超聲波輔助乙醇提取紅泡刺藤總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)40%，料液比1∶30 （g/ml），超聲波提取時間45 min，超聲波提取功率175 W。在此條件下紅泡刺藤總黃酮含量可達28.07 mg/g（葉片）、24.66 mg/g（根）、19.06 mg/g（莖）、4.05 mg/g（果實），不同器官總黃酮含量差異顯著。紅泡刺藤各個器官的總黃酮對羥基自由基、DPPH自由基均有較好的清除能力，根、莖、葉、果實總黃酮對羥基自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50值）分別為1.620 mg/L、0.537 mg/L、3.655 mg/L和1.499 mg/L，清除能力大小順序為莖總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮>葉總黃酮;對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為7.856 mg/L、3.559 mg/L、5.481 mg/L和5.574 mg/L，清除能力大小順序為莖總黃酮>葉總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮。

試驗測得紅泡刺藤果實總黃酮含量為4.05 mg/g，高于紅樹莓果實的1.52 mg/g[29];葉片總黃酮含量為28.07 mg/g，高于五月份新疆樹莓葉片的2.116 mg/g[30]和湖南省秋季山莓葉的2.03 mg/g。其原因可能是懸鉤子屬植物不同種間存在差異，紅泡刺藤的總黃酮含量高于上述幾種懸鉤子屬植物，也有可能是不同產(chǎn)地和不同生長期的懸鉤子總黃酮含量的動態(tài)變化所致。

抗氧化性試驗結(jié)果表明，紅泡刺藤各個器官總黃酮粗提液清除自由基的能力與總黃酮質(zhì)量濃度呈明顯的計量效應(yīng)，與樹莓提取物抗氧化能力試驗結(jié)果相同[31]。但紅泡刺藤不同器官提取的總黃酮的羥基自由基和DPPH自由基清除能力表現(xiàn)不同：對羥基自由基清除能力表現(xiàn)為莖總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮>葉總黃酮，對DPPH自由基清除能力表現(xiàn)為莖總黃酮>葉總黃酮>果實總黃酮>根總黃酮。這可能是因為粗提液中黃酮單體種類和含量不一所致。竹葉中黃酮提取物的抗氧化性研究結(jié)果也顯示同一濃度的粗提物在幾個抗氧化指標(biāo)中表現(xiàn)和排序不一致的情況[32]。也可能是由于羥基自由基和DPPH自由基清除率分別考察的是粗提物的得電子能力和供氫能力，不同粗提物在這2個能力上存在差異。研究結(jié)果表明紅泡刺藤總黃酮具有良好的抗氧化能力。

致謝：本研究得到國家留學(xué)基金資助！

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（責(zé)任編輯：張震林）