山芝麻中β-谷甾醇的定性和定量分析

陳 貴 夏稷子 徐作剛

黔南州檢驗檢測院，貴州 都勻 558000

山芝麻為梧桐科植物山芝麻HelicteresangustifoliaL.的干燥根，具有解表清熱、解毒消腫的功效，用于感冒高熱、扁桃體炎、咽喉炎、腮腺炎、皮膚濕疹、癰腫等[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究[3-4]表明，山芝麻具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用。β-谷甾醇是山芝麻中的一種甾醇類物質(zhì)，具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[5-6]。目前還未見山芝麻中β-谷甾醇含量測定的相關(guān)報道。本實驗通過TLC法對山芝麻中的β-谷甾醇進(jìn)行定性鑒別，并采用HPLC法對其含量進(jìn)行測定，為山芝麻的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與材料

LC-2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AG135型十萬分之一電子天平、AL204型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特公司)；SK250LHC型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)公司)。山芝麻對照藥材(批號：121088-201103)，β-谷甾醇對照品(批號：110851-201909，含量以92.7%計)，購于中國食品藥品檢定研究院； G型硅膠板(批號：20180619)，青島海洋化工有限公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。山芝麻藥材(批號：20190401、20190501、20190901)購于藥材市場，經(jīng)黔南州檢驗檢測院夏稷子主任藥師鑒定為梧桐科山芝麻HelicteresangustifoliaL.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別[7-9]

2.1.1 供試品溶液制備 取山芝麻粉末2.5 g，加30 mL三氯甲烷超聲處理30 min，過濾后的濾液置水浴上蒸干，殘渣用2 mL三氯甲烷使其溶解，即得。

2.1.2 對照藥材溶液制備 取山芝麻對照藥材2.5 g，同“2.1.1”項下方法制備對照藥材溶液。

2.1.3 對照品溶液制備 取β-谷甾醇對照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 鑒別 按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取以上三種溶液各2 μL，分別點于同一G型硅膠薄層板上，置展開劑為石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(5∶1)的展開缸內(nèi)展開，取出后晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜在與山芝麻對照藥材色譜和β-谷甾醇對照品色譜對應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點，TLC色譜圖見圖1。

2.2 HPLC含量測定

2.2.2 對照品儲備液的制備 取β-谷甾醇對照品，加入甲醇制成每1 mL含184.7 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山芝麻粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量后加熱回流30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下的對照品儲備液1 mL置于2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得系列濃度對照品溶液。取“2.2.2”項下對照品儲備液及上述5個稀釋濃度的溶液測定峰面積。以β-谷甾醇對照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制工作曲線，得回歸方程Y=2676.7X+2649.8(r=0.9999)，線性范圍為3.694～184.7 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.4”項下稀釋至10 mL的對照品溶液，照“2.2.1”項下的條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄β-谷甾醇的峰面積，結(jié)果RSD為0.65%。表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取山芝麻樣品(批號：20190501)，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8和12 h照“2.2.1”項下條件測定β-谷甾醇的含量。結(jié)果其含量的RSD為2.73%。表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取山芝麻樣品(批號：20190501)，照“2.2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，照“2.2.1”項下的條件測定。結(jié)果測得6份供試品中β-谷甾醇含量的平均值為0.188 mg/g，RSD為1.84%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率 取β-谷甾醇對照品，加甲醇制成每1 mL含18.47 μg的加樣回收用儲備液。取山芝麻樣品(批號：20190501)粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，精密加入上述加樣回收用儲備液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，稱定重量后加熱回流30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，制得加樣回收供試品溶液，照“2.2.1”項下的條件進(jìn)行測定，計算β-谷甾醇的加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測試結(jié)果 (n=6)

2.2.9 樣品測定 分別取批號為20190401、20190501和20190901的山芝麻樣品，各批次均照“2.2.3”項下方法平行制備3份供試品溶液，照“2.2.1”項下條件，外標(biāo)法測定β-谷甾醇的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同批次樣品中β-谷甾醇的含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 TLC展開劑比例的選擇 實驗考察了石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯不同比例(5∶1、7∶1和9∶1)的影響，結(jié)果三種展開劑比例下β-谷甾醇的Rf值分別為0.43、0.30和0.24，當(dāng)展開劑比例為5∶1時，β-谷甾醇Rf值適中，且與相鄰斑點有更好的分離度，故選擇展開劑比例為5∶1。

3.2 HPLC檢測波長的選擇 實驗在200～400 nm波長范圍內(nèi)對β-谷甾醇進(jìn)行了光譜掃描，結(jié)果在此范圍內(nèi)β-谷甾醇均無最大吸收，在低波長下有較大吸收。實驗比較了檢測波長(205、208和210 nm)的影響，結(jié)果在210 nm下基線較其他兩個波長更平穩(wěn)，因此實驗選擇210 nm作為HPLC檢測波長。

3.3 HPLC提取條件的選擇 實驗考察了提取方式、提取時間對樣品中β-谷甾醇提取的影響。在提取時間均為30 min的情況下，超聲提取所得β-谷甾醇含量為加熱回流提取的84.7%；采用加熱回流提取，不同提取時間(15、30和45 min)所得β-谷甾醇的含量分別為0.178、0.184和0.185 mg/g。因此，實驗選擇加熱回流提取30 min作為β-谷甾醇HPLC測定的提取條件。

本實驗建立的TLC方法在3批次山芝麻樣品中重復(fù)性好，所得β-谷甾醇斑點清晰，且與相鄰斑點分離度良好；采用HPLC法測定β-谷甾醇的含量，方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于山芝麻的質(zhì)量控制。