玉米黃粉預(yù)處理工藝優(yōu)化及其蛋白水解成分分析

皮詩宇,王常高,杜 馨,蔡 俊

(湖北工業(yè)大學(xué),工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,發(fā)酵工程教育部重點實驗室,工業(yè)微生物湖北省重點實驗室,湖北武漢 430068)

玉米是世界上三大糧食作物之一,不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位,而且是工業(yè)生產(chǎn)中淀粉、淀粉糖、酒精的主要原料[1],具有食用、飼用等多種工業(yè)用途,是世界上最有發(fā)展前途的谷物[2]。玉米黃粉(Corn gluten meal,CGM,又稱玉米蛋白粉)[3],是玉米濕法生產(chǎn)淀粉或提取乙醇后的副產(chǎn)品。玉米黃粉的組成成分大致為蛋白質(zhì)[4-5]、淀粉、纖維素、維生素A等,同時還含有15種無機(jī)鹽及玉米獨有的黃色素[6-7],由此可見,玉米黃粉的營養(yǎng)利用價值較高。由于玉米黃粉硬度較高,水分含量較少,且難溶于水[8-9],在食品行業(yè)中的應(yīng)用受到很大限制,很多玉米淀粉生產(chǎn)工廠都將玉米黃粉作為廉價飼料進(jìn)行出售[10-11],這不僅造成了環(huán)境的污染,而且造成了資源的浪費[12]。

玉米黃粉中玉米蛋白有很高的利用價值,但由于蛋白的分子質(zhì)量較大[13-15],并且其中玉米醇溶蛋白不溶于水,造成玉米蛋白在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用受限。因此國內(nèi)外許多學(xué)者對玉米蛋白水解物的制備做了研究工作,其研究的核心是最大限度地提高玉米蛋白的水解度[16]。目前,以玉米黃粉為原料制備玉米蛋白水解物的方法主要有堿法和酶法。堿法雖然簡單易行,但存在著許多難以克服的不足,如水解時間長、可溶性成分去除不徹底、產(chǎn)品純度低、灰分高、色澤深和蛋白發(fā)泡粉得率低等問題;酶法[17]水解作用條件溫和、水解產(chǎn)物具有活性成分,通過酶法改性玉米蛋白提高其水溶性及某些功能特性,這種方法具有可控性強(qiáng),耗能少、專一性強(qiáng)和副產(chǎn)物少等優(yōu)點[18-22],但玉米黃粉中含有淀粉和纖維素等雜質(zhì),為酶法水解玉米蛋白造成阻礙[23]。

本研究以玉米黃粉為原料,采用α-淀粉酶和纖維素酶對原料預(yù)處理,對兩種酶分別進(jìn)行單因素實驗,在單因素實驗基礎(chǔ)上探究兩種酶復(fù)合添加的順序,并進(jìn)行兩種酶復(fù)合添加的正交試驗,確定最佳提取玉米濃縮蛋白的工藝。然后對提取的玉米濃縮蛋白進(jìn)行蛋白酶水解得到玉米蛋白水解物,分析了其組成及含量,以期為后續(xù)開發(fā)利用玉米黃粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米黃粉 山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司;α-淀粉酶(2100 U/mL)、纖維素酶(12500 U/mL) 武漢新華揚生物股份有限公司;亞硫酸鈉 國藥集團(tuán);木瓜蛋白酶(80 萬U/g) 廣州市華琪生物科技有限公司;堿性蛋白酶(10 萬U/g)、中性蛋白酶(10萬 U/g)、酸性蛋白酶(10萬 U/g) 諾維信生物技術(shù)有限公司;氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 武漢市華順生物技術(shù)有限公司。

FD-2型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;KDN-12C型消化爐、KDN-1000型全自動定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司;DD5M型低速大容量多管架離心機(jī) 長沙平凡儀器有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米黃粉主要成分測定 總蛋白:GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》;淀粉:GB 5009.9-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測定》;油脂:GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》;粗纖維:GB/T5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》;水分:GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》。

1.2.2 玉米黃粉預(yù)處理及其蛋白水解工藝流程

圖1 玉米黃粉預(yù)處理及其蛋白水解試驗流程Fig.1 Corn gluten meal pretreatment and proteolysis test process

離心、水洗:將預(yù)處理后的樣品以8000 r/min離心15 min,收集沉淀,加入一定量的水制成1∶4 g/mL溶液進(jìn)行水洗,水洗3次后離心,收集沉淀。通過α-淀粉酶和纖維素酶酶處理后的淀粉和纖維素的水解物大部分溶解于溶液中形成小分子的糖類物質(zhì),未被水解的玉米蛋白大部分存在于沉淀中。將酶解物進(jìn)行離心后洗滌,離心和洗滌的過程中可能會有部分玉米蛋白流失,但玉米蛋白不溶于水,因此玉米蛋白在上清中的含量基本可以忽略。

沉淀真空冷凍干燥:選擇最終優(yōu)化后的預(yù)處理水解條件,將沉淀放置真空冷凍干燥器中,濃縮至樣品呈粉末狀。

8%亞硫酸鈉預(yù)處理:稱取一定量的玉米濃縮蛋白粉,按1∶4 g/mL料水比均勻分散在水中,加入8%的亞硫酸鈉,在溫度45 ℃下變性30 min[24]。

蛋白酶水解:稱取一定量熱變性后的玉米濃縮蛋白加入一定的蛋白酶在最適水解條件下進(jìn)行反應(yīng),得到的最終產(chǎn)物在沸水浴中酶滅活10 min。

離心:將上述酶滅活后的樣品以8000 r/min離心15 min,收集上清液。

1.2.3α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理條件優(yōu)化 根據(jù)α-淀粉酶和纖維素酶的最適條件、酶活大小及原料相關(guān)物質(zhì)的含量[25-26],初步確定α-淀粉酶的初始水解條件為溫度70 ℃,pH6.5,加酶量1.0%,水解時間1 h,料水比1∶4 g/mL;纖維素酶的初始水解條件為溫度55 ℃,pH5.5,加酶量1.5%,水解時間4 h,料水比1∶3 g/mL。在初始水解條件的基礎(chǔ)上,單一改變溫度、pH、加酶量、時間、料水比水解條件,得到玉米黃粉水解物離心、洗滌后,取沉淀進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定,分析利用α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理玉米黃粉對玉米蛋白回收率的影響[27-28]。

1.2.4α-淀粉酶單一預(yù)處理玉米黃粉單因素實驗

1.2.4.1 酶解溫度對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在pH6.5,加酶量1.0%,水解時間1 h,料水比1∶4 g/mL,研究酶解溫度為60、65、70、75、80 ℃對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.4.2 酶解pH對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度70 ℃,加酶量1.0%,水解時間1 h,料水比1∶4 g/mL,研究pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.4.3 加酶量對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度70 ℃,pH6.5,水解時間1 h,料水比1∶4 g/mL,研究加酶量為0.0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.4.4 酶解時間對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度70 ℃,pH6.5,加酶量1.0%,料水比1∶4 g/mL,研究酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.4.5 酶解料水比對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度70 ℃,pH6.5,加酶量1.0%,水解時間1 h,研究料水比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 g/mL對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.5 纖維素酶單一預(yù)處理玉米黃粉單因素實驗

1.2.5.1 酶解溫度對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在pH5.5,加酶量1.5%,水解時間4 h,料水比1∶3 g/mL,研究酶解溫度為45、50、55、60、65 ℃對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.5.2 酶解pH對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度55 ℃,加酶量1.5%,水解時間4 h,料水比1∶3 g/mL,研究pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.5.3 加酶量對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度55 ℃,pH5.5,水解時間4 h,料水比1∶3 g/mL,研究加酶量為0.0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.5.4 酶解時間對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度55 ℃,pH5.5,加酶量1.5%,料水比1∶3 g/mL,研究酶解時間為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.5.5 酶解料水比對玉米蛋白回收率的影響 稱取玉米黃粉5 g,在溫度55 ℃,pH5.5,加酶量1.5%,水解時間4 h,研究料水比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL對玉米蛋白回收率的影響。

1.2.6α-淀粉酶和纖維素酶復(fù)合預(yù)處理條件優(yōu)化 玉米黃粉中的淀粉和纖維素與玉米蛋白結(jié)合緊密,纖維素主要由木質(zhì)素和非淀粉多糖組成,而木質(zhì)素對酶有非特異性吸附降低酶解效果[29-30]。因此兩種酶單一預(yù)處理試驗基礎(chǔ)下,分析兩種酶復(fù)合添加順序?qū)τ衩椎鞍缀亢陀衩椎鞍谆厥章实挠绊?初步判斷玉米黃粉中淀粉、纖維素與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)系,再利用正交試驗進(jìn)一步檢驗兩種酶復(fù)合水解條件,提高玉米蛋白含量[31]。

1.2.6.1α-淀粉酶和纖維素酶的添加順序 在兩種酶單一預(yù)處理試驗基礎(chǔ)下,將玉米黃粉先利用α-淀粉酶水解后,在沸水浴中加熱10 min進(jìn)行酶滅活,離心、洗滌后取沉淀,將沉淀利用纖維素酶再進(jìn)一步水解后酶滅活、離心、洗滌后取沉淀。將兩種酶的添加順序更換后利用上述方法重復(fù)操作,所得的兩種沉淀進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率的測定,判斷兩種酶的添加順序。

1.2.6.2 玉米黃粉預(yù)處理的正交試驗 根據(jù)兩種酶單一預(yù)處理試驗結(jié)果,分別選擇α-淀粉酶和纖維素酶的加酶量和酶解時間四個影響因素為自變量,以玉米蛋白回收率為指標(biāo),選擇L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化玉米黃粉提取玉米蛋白的正交試驗,因素水平見表1。

表1 α-淀粉酶和纖維素酶復(fù)合 預(yù)處理玉米黃粉正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of corn gluten meal pretreatment with α-amylase and cellulase complex

1.2.7 玉米蛋白含量和玉米蛋白回收率的計算 玉米蛋白含量通過1.2.1方法進(jìn)行測定,玉米蛋白回收率計算公式如下:

蛋白質(zhì)回收率(%)=酶處理后干物質(zhì)蛋白質(zhì)質(zhì)量/酶處理前干物質(zhì)蛋白質(zhì)質(zhì)量×100

1.2.8 玉米蛋白水解產(chǎn)物的制備

1.2.8.1 蛋白酶種類的選擇 選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶作為水解玉米蛋白的水解酶[32-33]。在加酶量、反應(yīng)時間、料水比相同的條件下,選取四種酶各自最適水解pH和溫度,四種酶的最適條件見表2,在該條件下對玉米濃縮蛋白粉進(jìn)行水解。

由發(fā)泡高度和失水率可知玉米蛋白中的肽鏈?zhǔn)欠窬哂泻芎玫目蛊茐哪芰?這是應(yīng)用玉米蛋白的先決條件。因此根據(jù)表2條件,四種蛋白酶與定量玉米濃縮蛋白粉反應(yīng)后,以玉米蛋白水解度、溶解度、發(fā)泡高度和失水率為指標(biāo)確定最適蛋白酶的種類。

表2 不同蛋白酶水解玉米蛋白的反應(yīng)條件Table 2 Reaction conditions for hydrolysis of zein by different protease

1.2.8.2 玉米蛋白水解度、發(fā)泡高度和失水率的計算方法:

其中游離氨基氮用甲醛滴定法測量,總氮用凱氏定氮法測量。

1000 mL空燒杯中放入25 g樣品,加入200 mL水,于30 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min。在高轉(zhuǎn)速下打泡直至全部形成泡沫,測量發(fā)泡高度(mm),稱量總泡沫質(zhì)量(m1),2 h后,倒出液體稱量液體質(zhì)量(m2),計算玉米蛋白失水率(%)。

1.2.8.3 玉米蛋白水解產(chǎn)物成分分析 通過2,4-二硝基氟苯法檢測氨基酸,應(yīng)用外標(biāo)法對照20種標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖,分析玉米蛋白水解物的組成成分[34]。

流動相A:0.04 mol/L無水乙酸鈉溶液(取3.56 g無水乙酸鈉,溶于1 L超純水中,加入0.1%三乙胺,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.4);流動相B:50%乙腈水溶液;檢測波長:360 nm;流速:1 mL/min;色譜柱:C18VP-ODS(5 μm,250 mm×4.6 mm);梯度洗脫:0～20 min,70% A,80% B;20～26 min,64% A,36% B;26～41 min,45% A,55% B;41～46 min,35% A,65% B;46～48 min,10% A,90% B;48～54 min,2% A,98% B;54～60 min,30% A,70% B。

二十種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備:稱取異亮氨酸25 mg,酪氨酸10 mg,其余氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸)各50 mg,分別用pH9.0硼酸緩沖液溶解,定溶至10 mL。取異亮氨酸1 mL,酪氨酸2.5 mL,其余氨基酸各0.5 mL,混合后用pH9.0硼酸緩沖液定溶至25 mL,所得溶液為二十種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品。

混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品用pH9.0硼酸稀釋,得到5種不同濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)。取0.1 mL樣品溶液,加入到1 mL棕色容量瓶中,分別加入0.05 mol/L磷酸緩沖液和2,4-二硝基氟苯各0.1 mL,放入60 ℃水浴中,暗處反應(yīng)60 min。取出,冷卻至室溫,用平衡緩沖液(pH7.0磷酸緩沖液)定容至1 mL,靜置15 min,取20 μL進(jìn)行液相色譜分析。測定結(jié)果以峰面積y對氨基酸濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程為y=68993.2+23303.4x,R2=0.9999。

配制濃度為1.0 mg/mL的玉米蛋白水解物,按混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定玉米蛋白水解物中氨基酸組成和含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件設(shè)計正交試驗方案,用Excel 2013軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米黃粉中相關(guān)成分的測定結(jié)果

由表3可知,玉米黃粉中的蛋白質(zhì)含量占比最高，為51.29%,較菜籽粕中蛋白質(zhì)含量高出11%左右[35],較豆粕中蛋白質(zhì)含量高出20%左右[36]。但玉米傳統(tǒng)法提取玉米淀粉后,得到的玉米黃粉中淀粉、粗纖維雜質(zhì)含量較高,分別為20.6%和7.4%,阻礙了玉米黃粉中蛋白質(zhì)的應(yīng)用。因此本文利用α-淀粉酶和纖維素酶除去玉米黃粉中的淀粉和纖維素,使玉米黃粉中玉米蛋白更純、含量更高,從而更好的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品行業(yè)。

表3 玉米黃粉中各成分的含量Table 3 Content of each component in corn gluten meal

2.2 α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理條件優(yōu)化

2.2.1 酶解溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響 由圖2可知,隨著兩種酶水解溫度的升高,玉米蛋白回收率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)α-淀粉酶水解溫度為65 ℃時,玉米蛋白回收率最高為87.03%;當(dāng)纖維素酶水解溫度為50 ℃時,玉米蛋白回收率最高為74.6%。水解溫度主要影響酶活性,故酶反應(yīng)需在酶的最適溫度范圍內(nèi),超過酶的最適溫度,酶活會隨著溫度的升高而逐漸失活。因此,α-淀粉酶水解最適溫度為65 ℃,纖維素酶水解最適溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對玉米蛋白回收率的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on zein recovery rate

2.2.2 酶解pH對蛋白質(zhì)回收率的影響 由圖3可知,隨著兩種酶水解pH的升高,玉米蛋白回收率先增加后降低。當(dāng)α-淀粉酶水解pH為6.5時,玉米蛋白回收率最高為84.19%;當(dāng)纖維素酶水解pH為5.0時,玉米蛋白回收率最高為72.91%。水解pH對酶活有一定影響,酶活在最適pH范圍內(nèi)隨著pH的增加而增大,當(dāng)超過最適pH范圍,酶活會逐漸降低。因此,α-淀粉酶水解最適pH為6.5,纖維素水解最適pH為5.0。

圖3 酶解pH對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of pH on zein recovery rate

2.2.3 加酶量對玉米蛋白回收率的影響 由圖4可知,隨著兩種酶加酶量的增加,玉米蛋白回收率逐漸增加,加酶量增加到一定值后,玉米蛋白回收率基本不變。當(dāng)α-淀粉酶加酶量為1.0%時,玉米蛋白回收率最高為89.51%;當(dāng)纖維素酶加酶量為1.0%時,玉米蛋白回收率最高為70.72%。根據(jù)酶促反應(yīng)動力學(xué)原理,底物濃度一定時,隨著加酶量的增加,會加速酶解過程,底物逐漸消耗完畢,進(jìn)一步增大加酶量,此時沒有底物與酶進(jìn)行反應(yīng),從而造成酶的浪費。因此,α-淀粉酶最適加酶量為1.0%,纖維素酶最適加酶量為1.0%。

圖4 加酶量對玉米蛋白回收率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on zein recovery rate

2.2.4 酶解時間對玉米蛋白回收率的影響 由圖5可知,隨著兩種酶水解時間的增加,玉米蛋白回收率先增加到一定量后逐漸保持穩(wěn)定。當(dāng)α-淀粉酶水解時間為1.0 h時,玉米蛋白回收率最高為82.33%;當(dāng)纖維素酶水解時間為3.0 h時,玉米蛋白回收率最高為70.22%。隨著酶水解時間的增加,酶活有所降低。因此,α-淀粉酶水解最適時間為1.0 h,纖維素酶水解最適時間為3.0 h。

圖5 酶水解時間的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on zein recovery rate

2.2.5 料水比對玉米蛋白回收率的影響 由圖6可知,隨著兩種酶料水比的增加,玉米蛋白回收率呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)α-淀粉酶的料水比為1∶4 g/mL時,玉米蛋白回收率最高為90.01%;當(dāng)纖維素酶的料水比為1∶3 g/mL時,玉米蛋白回收率最高為71.67%。當(dāng)料水比較小時,玉米黃粉與水解酶沒有足夠的接觸面積;當(dāng)料水比過大時,溶液稀釋過度,酶水解效果減弱。因此,α-淀粉酶的最適料水比為1∶4 g/mL,維素酶的最適料水比為1∶3 g/mL。

圖6 料水比對玉米蛋白回收率的影響Fig.6 Effect of material to water ratioon zein recovery rate

2.3 α-淀粉酶和纖維素酶復(fù)合預(yù)處理玉米黃粉條件優(yōu)化

2.3.1α-淀粉酶和纖維素酶的添加順序?qū)Φ鞍踪|(zhì)回收率的影響 如表4所示,在α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理水解最優(yōu)條件下,先用纖維素酶處理再用α-淀粉酶處理得到的蛋白質(zhì)回收率為95.6%,相比單一使用α-淀粉酶和纖維素酶水解玉米黃粉,兩種酶復(fù)合處理得到的玉米蛋白回收率分別提高了5.59%和20.98%。因此可初步判斷纖維素可能存在于蛋白質(zhì)和淀粉外部,阻礙淀粉和蛋白質(zhì)的提取,淀粉可能與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密并被纖維素包裹,當(dāng)纖維素酶水解纖維素后,α-淀粉酶才能進(jìn)一步將玉米黃粉中的淀粉去除。

表4 α-淀粉酶和纖維素酶的添加順序 對蛋白質(zhì)回收率的影響Table 4 Effect of α-amylase and cellulase addition order on protein recovery

2.3.2α-淀粉酶和纖維素酶復(fù)合預(yù)處理玉米黃粉正交試驗 由α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理試驗可以看出,在酶的各反應(yīng)條件中,玉米蛋白回收率均隨著溫度、pH和料水比的增大先增加后降低,而玉米蛋白回收率隨著加酶量與酶解時間的增大先增大后逐漸穩(wěn)定。因此選取α-淀粉酶和纖維素酶的加酶量、酶解時間在單因素中的最適范圍做正交試驗,找出能降低酶用量或縮短反應(yīng)時間的條件組合。

表5 α-淀粉酶和纖維素酶 復(fù)合預(yù)處理玉米黃粉正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of α-amylase and cellulase compound pretreatment of corn gluten meal

由表6可知,通過方差分析各因素對玉米蛋白回收率影響程度為α-淀粉酶水解時間>纖維素酶加酶量>α-淀粉酶加酶量>纖維素酶水解時間。通過正交試驗結(jié)果得出α-淀粉酶和纖維素酶復(fù)合處理玉米黃粉的最優(yōu)組合方案為A2B1C2D1,即α-淀粉酶加酶量1.0%、水解時間0.5 h,纖維素酶加酶量1.0%、水解時間2.5 h。

表6 α-淀粉酶和纖維素酶 復(fù)合預(yù)處理玉米黃粉正交試驗方差分析Table 6 Analysis of variance of orthogonal test of corn gluten meal pretreated byα-amylase and cellulase

綜合α-淀粉酶和纖維素酶單一預(yù)處理和復(fù)合正交試驗,確定纖維素酶處理條件為水解溫度50 ℃,pH5.0,加酶量1.0%,水解時間2.5 h,料水比1∶3 g/mL;α-淀粉酶處理條件為水解溫度65 ℃,pH6.5,加酶量1.0%,水解時間0.5 h,料水比1∶4 g/mL。

2.3.3 驗證試驗 如表7所示,正交最優(yōu)條件、單因素最優(yōu)條件的酶處理效果相差不大,正交最優(yōu)條件酶用量相對較少,故最終選擇正交最優(yōu)條件,得到的干物質(zhì)蛋白質(zhì)含量為89.9%,蛋白質(zhì)回收率為96.1%,相較于未處理的玉米黃粉的玉米蛋白,通過α-淀粉酶和纖維素酶處理后的玉米蛋白含量提高了38.51%,相較于利用亞臨界脫脂、淀粉酶酶解工藝處理制備的玉米濃縮蛋白[27],本研究得到的玉米蛋白含量提高了8%左右。最終產(chǎn)物通過真空冷凍干燥得到玉米濃縮蛋白粉。

表7 正交最優(yōu)條件與單因素最優(yōu)條件的酶處理效果對比Table 7 Comparison of enzyme treatment effects between orthogonal optimal conditions and single factor optimal conditions

2.4 玉米蛋白水解物的制備和組分分析

2.4.1 不同蛋白酶水解玉米濃縮蛋白粉的效果比較 如表8所示,木瓜蛋白酶的水解度、溶解度較低,但具有較好的發(fā)泡性能;堿性蛋白酶有較好的水解度,且溶解度高,有較好的發(fā)泡性能;中性蛋白酶和酸性蛋白酶雖然有較好的水解度,但發(fā)泡性能較差。綜上所述,選擇堿性蛋白酶水解玉米濃縮蛋白粉,得到的水解度為14.2%,溶解度為68.6%,發(fā)泡高度為64 mm,失水率為16%。

表8 不同蛋白酶水解玉米濃縮蛋白粉的效果比較Table 8 Comparison effects of different proteases on the hydrolysis of corn gluten meal

2.4.2 玉米蛋白水解物液相色譜圖分析 圖7為二十種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜出峰保留時間和峰面積,將玉米蛋白通過堿性蛋白酶最適條件水解后,利用高效液相色譜測定玉米蛋白水解物中的組成成分,得到圖8所示結(jié)果。

圖7 二十種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatogram of twenty amino acid standards

圖8 玉米蛋白水解物液相色譜圖Fig.8 Liquid chromatogram of corn gluten meal protein hydrolysate

結(jié)合圖7,得到的圖8中虛線所在位置為玉米蛋白水解物中二十種氨基酸液相色譜出峰保留時間和峰面積。由于堿性蛋白酶專一水解蛋白,因此水解后離心取上清液中,含有氨基酸、未被水解徹底的多肽和蛋白質(zhì)。由圖8可知,堿性蛋白酶水解玉米蛋白后得到的玉米蛋白水解物中二十種氨基酸含量為35.72%,剩余64.28%的可溶性氮以多肽或蛋白質(zhì)的形式存在。

2.4.3 玉米蛋白水解物的氨基酸組成與含量 根據(jù)圖7和圖8,通過方法1.2.8.3得出玉米蛋白水解物的氨基酸組成與含量如表9所示:

表9 玉米蛋白水解物的氨基酸組成與含量Table 9 Amino acid composition and content of zein hydrolysate

由表9可知,玉米蛋白水解物中二十種氨基酸的組成與含量。其中谷氨酰胺和亮氨酸含量最高分別為17.49%和17.68%,谷氨酰胺可用于治療胃及十二指腸潰瘍、胃炎及胃酸過多,也可參與谷胱甘肽合成等作用[37-38];亮氨酸是最有效的一種支鏈氨基酸,可以有效防止肌肉損失,有助于調(diào)節(jié)血糖水平等作用[39]。玉米蛋白中7種必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)含量高于FAO/WHO推薦值[40],其中纈氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸含量高出FAO/WHO推薦值1倍左右。綜合分析本試驗得到的玉米蛋白及其水解物有很好的醫(yī)藥、食品等發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結(jié)論

玉米黃粉中含有一定量的淀粉和纖維素成分,這些是玉米濕法提取過程中不易去除的成分。本研究采用α-淀粉酶和纖維素酶相結(jié)合的雙酶法預(yù)處理玉米黃粉,進(jìn)行單因素實驗和正交試驗得出結(jié)論:先用纖維素酶處理,再采用α-淀粉酶處理,得到淺黃色的玉米濃縮蛋白粉。纖維素酶處理條件為水解溫度50 ℃,pH5.0,加酶量1.0%,水解時間2.5 h,料水比1∶3 g/mL;α-淀粉酶處理條件為水解溫度65 ℃,pH6.5,加酶量1.0%,水解時間0.5 h,料水比1∶4 g/mL。預(yù)處理后所得的玉米濃縮蛋白粉用8%的亞硫酸鈉熱變性處理,利用堿性蛋白酶水解熱變性玉米濃縮蛋白粉,得到的水解度為14.2%,溶解度為68.6%,發(fā)泡高度為64 mm,失水率為16%。通過高效液相色譜得到玉米蛋白水解物中氨基酸含量為35.72%,多肽和未水解的蛋白質(zhì)含量為64.28%,基本符合FAO/WHO推薦值。

利用α-淀粉酶和纖維素酶對玉米黃粉進(jìn)行預(yù)處理除去淀粉和纖維素,得到的玉米黃粉水解物沉淀中玉米蛋白更純、含量更高,通過酶法得到的玉米蛋白綠色環(huán)保。相較于未處理的玉米黃粉,本試驗得到的玉米黃粉中蛋白質(zhì)含量提高了38.51%;相較于單一預(yù)處理酶法[39],玉米蛋白含量提高了8%左右。并且玉米黃粉水解物的上清液中含有大量小分子糖類,可為食品等行業(yè)進(jìn)一步利用。根據(jù)玉米蛋白氨基酸含量與組成的分析,進(jìn)一步確定玉米黃粉經(jīng)過處理可在醫(yī)藥、食品等行業(yè)應(yīng)用。