PGS構(gòu)建特定形狀脂肪組織的可行性研究

鮑婉婷 曹麗辰 魏昊 余力 周廣東 郭善禹

全世界每年約有140萬人被診斷為乳腺癌，我國僅2015年新發(fā)的乳腺癌患者就高達(dá)27.2萬余人。根治切除導(dǎo)致的乳房缺失帶給患者長期的心理問題不容忽視。因此，在不斷改進(jìn)乳腺癌手術(shù)方法的同時(shí)，“乳房重建”的概念日趨受到重視。除了現(xiàn)行的肌皮瓣轉(zhuǎn)移、硅膠假體植入以及自體脂肪移植，組織工程技術(shù)的發(fā)展也為乳房重建開辟了新的途徑，通過組織工程技術(shù)構(gòu)建大體積脂肪組織在乳房再造中具有潛在的應(yīng)用前景。

結(jié)合正常乳房組織特點(diǎn)，脂肪組織工程支架應(yīng)具備一定的韌度與強(qiáng)度，因?yàn)椴粌H要抵抗細(xì)胞收縮力引起的形狀改變，還要承受在組織再生過程中的切口收縮力。此外，在睡眠和體育活動中，乳房區(qū)域也承受著較高的生物力學(xué)負(fù)荷，因此組織構(gòu)建物必須有一定的剛度[1]。然而，值得注意的是，剛性支架雖然在組織再生的過程中可起到保護(hù)作用，但若造成明顯的不適感，其臨床價(jià)值也是有待商榷的。相關(guān)研究中，合成聚合物支架(如PLA、PCL等)都剛性偏大。Patric[2]認(rèn)為這類聚合物多孔支架可能并非乳房組織工程的最佳選擇。材料學(xué)和工程學(xué)的發(fā)展，使制備富有彈性、可降解、力學(xué)性能接近或稍高于正常乳房乳腺組織的三維多孔支架成為可能。

聚葵二酸甘油酯(PGS)是一種新型可生物降解的彈性聚合材料[3-4]，其彈性模量介于肌腱與韌帶之間，并且細(xì)胞相容性好，動物體內(nèi)周圍組織炎癥、纖維化反應(yīng)輕，以表面侵蝕的方式降解，不伴有膨脹或變形?；谝陨狭己玫纳飳W(xué)及力學(xué)性能，PGS主要應(yīng)用于軟組織替代以及軟組織工程，比如心肌[5]、神經(jīng)[6]、角膜修復(fù)[7]、動脈重建[8]、軟骨組織工程[9]、鼓膜修補(bǔ)[10]等。然而，鮮有報(bào)道將其用于脂肪組織工程領(lǐng)域。

本研究將探討PGS支架構(gòu)建大體積特定形狀脂肪組織的可能性，以期為乳腺癌術(shù)后采用組織工程技術(shù)構(gòu)建乳房奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

低糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、胎牛血清(Gibco，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen，美國)；SEM(Philips XL-30，荷蘭)；生物力學(xué)分析儀(Instron，美國)；PGS支架(上海銳圖生物材料有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

4周齡雌性裸鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動物倫理原則。

1.3 PGS支架的制備及表征分析

PGS用四氫呋喃溶解，按PGS∶鹽=9∶1加入經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)篩過篩后的標(biāo)準(zhǔn)鹽(粒徑224～300 μm)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅逑慈コ軇?。將可流動的共混物加入定制的半球形模具中，待成型后脫模，用去離子水進(jìn)行鹽析處理。

掃描電鏡觀察多孔支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)與形態(tài)，測量孔徑大小。支架的孔隙率按照稱重法進(jìn)行測量：①比重瓶裝滿乙醇稱重為W1；②支架稱重Ws, 完全浸入比重瓶乙醇中使其充分浸透；③加滿比重瓶中乙醇，稱重W2；④取出支架，剩下部分稱重W3。支架孔隙率E=(W2-W3-Ws)/(W1-W3)×100%。

1.4 脂肪及脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的獲取

脂肪來自于我院抽脂手術(shù)的健康成人，事先經(jīng)過患者知情同意。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

抽脂獲取的脂肪采用靜置法除掉腫脹液后，按1∶1加入0.1% Ⅰ型膠原酶消化1.5 h，離心取沉淀進(jìn)行原代細(xì)胞接種分離培養(yǎng)。3 d后，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。選取生長良好的第3代ADSCs行多向分化鑒定。

1.5 體外細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

PGS支架經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，PBS預(yù)濕，置于24孔板中。選取生長良好的第3代ADSCs，消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×105cells/mL。將1 mL細(xì)胞懸液緩慢滴加到支架表面后，24孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，復(fù)合物取出后電鏡固定液固定，掃描電鏡觀察。

1.6 體內(nèi)脂肪復(fù)合實(shí)驗(yàn)

將抽脂獲得的脂肪組織用PBS洗滌后，剔除肉眼可見的血管和結(jié)締組織，然后用組織剪反復(fù)剪切直到呈均一勻漿狀。將組織勻漿經(jīng)雙層無菌醫(yī)用紗布過濾后離心(19 g)1 min，吸棄上層油脂，余下部分振蕩混勻，將滅菌后的PGS支架浸入脂肪處理物中30 min，備用。

將空白PGS支架(對照組，n=2)以及經(jīng)處理的PGS支架(實(shí)驗(yàn)組，n=2)植入裸鼠背部皮下，術(shù)后4周時(shí)連同周圍組織取材行組織學(xué)檢測，HE染色和Masson染色觀察材料降解情況和組織再生情況。

2 結(jié)果

2.1 PGS支架表征分析

PGS多孔支架大致呈半球形，直徑約10 mm，厚度4 mm，疏松多孔，內(nèi)部呈海綿樣結(jié)構(gòu)；支架表面電鏡掃描顯示，多孔支架的孔隙分布均勻，孔徑形狀較規(guī)則，大小在200～300 μm之間(圖1)，孔隙率約為88%。

圖1 支架的大體觀察與電鏡觀察Fig. 1 Gross view and SEM observation of the scaffold

2.2 ADSCs的培養(yǎng)與鑒定

ADSCs原代細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)傳代后，第3代細(xì)胞呈細(xì)長梭形，貼壁生長(圖2 A)。ADSCs具有成骨、成脂分化能力，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色可見大量脂滴紅染(圖2B)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后茜素紅染色可見大量被紅染的礦結(jié)節(jié)(圖2C)。

A：第3代ADSCs(40×)；B：油紅O染色(100×)；C：茜素紅染色(100×) A: P3 ADSCs (40×); B: Oil red O dyeing (100×); C: Alizarin red staining (100×)圖2 ADSCs的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化。Fig. 2 In vitro culture and induced differentiation of ADSCs

2.3 體外細(xì)胞黏附觀察

ADSCs接種于PGS支架后7 d后，SEM觀察顯示，支架上可見細(xì)胞黏附并大量增殖，顯示出良好的細(xì)胞相容性(圖3)。

A、 B：PGS支架；C、D：ADSCs接種PGS支架7 d A, B: PGS scaffolds; C, D: 7 days after ADSCs seeded on the PGS scaffolds圖3 掃描電鏡觀察Fig. 3 SEM observation

2.4 動物實(shí)驗(yàn)大體與組織學(xué)觀察

體內(nèi)培養(yǎng)4周后取材，對照組PGS支架高度及直徑顯著減小，但依然維持類半球外形(圖4A、5B)，HE染色可見支架疏松多孔，內(nèi)部及邊緣浸潤少量紅染的炎性細(xì)胞(圖4C)。實(shí)驗(yàn)組支架高度及直徑明顯大于對照組，大體標(biāo)本可見復(fù)合物表面不規(guī)則分布淡黃色的脂肪組織，組織表面有豐富的血管網(wǎng)(圖4D、5E)，HE染色可見支架周圍有空泡樣細(xì)胞浸潤生長，考慮為存活的脂肪細(xì)胞，復(fù)合物內(nèi)部紅染的炎性細(xì)胞大量浸潤，表面有一層致密纖維組織包裹(圖4F)。

為了進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞浸潤生長情況，對組織切片進(jìn)行Masson染色，顯示植入物周圍包裹了一層藍(lán)染的膠原纖維組織，為增生的纖維包膜(圖5A)；包膜下支架周圍浸潤生長著色淺或無的脂肪細(xì)胞，側(cè)面(圖5D)脂肪細(xì)胞浸潤面積明顯多于底部(圖5C)，底部可見到融合的大空泡，考慮脂肪壞死形成的脂滴(圖5C)。在支架內(nèi)部，未見到明顯的細(xì)胞浸潤，多為支架和核深染的炎性細(xì)胞(圖5A、B)。

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)4周后大體及組織學(xué)觀察Fig. 4 Gross and histological observation after 4 weeks’ culture in vivo

圖5 實(shí)驗(yàn)組Masson染色觀察(B、C、D標(biāo)尺為500 μm)Fig. 5 Masson staining of the experimental group (Scale bars of B, C, D=500 μm)

3 討論

PGS鹽析支架蓬松，具有彈性，內(nèi)部疏松多孔。在細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)中，ADSCs接種支架7 d后，電鏡觀察可見ADSCs在支架表面黏附并成群增殖，驗(yàn)證了PGS支架良好的細(xì)胞相容性。在動物實(shí)驗(yàn)中，大體和組織學(xué)觀察顯示：①PGS支架可降解，并在降解過程中基本維持原有的外形。PGS材料體內(nèi)降解期約60 d，以表面侵蝕的方式進(jìn)行降解，降解過程中能夠維持外形不變和表面完整而質(zhì)量線性下降[4]。②體內(nèi)培養(yǎng)4周，植入物內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，比較對照組與實(shí)驗(yàn)組浸潤情況，我們認(rèn)為脂肪處理物加劇了炎癥反應(yīng)。一般情況下，脂肪移植過程中會盡量除掉油份，避免誘發(fā)、加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)。同時(shí)，我們也不能排除脂肪在處理過程中被污染。③植入物表面形成纖維包膜，且實(shí)驗(yàn)組較對照組更明顯。包膜攣縮是假體隆乳術(shù)后最為常見的并發(fā)癥，也有多項(xiàng)研究表明纖維包膜形成與假體表面材料類型、切口選擇、血腫發(fā)生、引流充分與否，以及植入?yún)^(qū)附近的亞臨床感染等因素相關(guān)[12-13]。脂肪處理物的潛在污染以及油脂誘發(fā)的炎癥滲出，都可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組纖維包膜厚于對照組的原因。④PGS支架僅見外周脂肪細(xì)胞浸潤生長，其側(cè)面脂肪細(xì)胞存活情況優(yōu)于底面。本實(shí)驗(yàn)中，采用浸沒的方式不能充分保證脂肪處理物完全滲透進(jìn)支架內(nèi)部，同時(shí)，可能由于支架內(nèi)部缺乏血管供應(yīng)，氧氣彌散距離有限，脂肪細(xì)胞即使浸潤分布到中央，存活比較困難。對于支架側(cè)面和底面脂肪細(xì)胞存活狀態(tài)的差異，機(jī)械壓力或許能夠解釋原因。當(dāng)脂肪組織受到壓力時(shí)，組織間微血管壓縮或閉塞，另外有研究表明機(jī)械力本身也會抑制ADSCs向脂肪分化[14]。

從機(jī)械性能和生物相容性方面來看，PGS支架對于構(gòu)建特定外形脂肪組織具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。3D打印基于計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)(CAD)，可以制作結(jié)構(gòu)和體系明確的三維定制多孔支架，能夠?qū)崿F(xiàn)乳房外形支架的精準(zhǔn)化和個性化。但是，由于PGS黏性較低，較少通過3D打印成型，多以靜電紡絲或傳統(tǒng)鹽析法制作支架[7，15-16]；并且因其固化需經(jīng)高溫處理，過程繁瑣，對于制作復(fù)雜外形支架具有局限性。然而，PGS經(jīng)修飾后可以獲得溫敏[17]或光敏性能[18]，能夠?qū)崿F(xiàn)打印過程中快速即時(shí)固化。如能籍此將3D打印與PGS材料結(jié)合，就有可能制備出具有類似乳房結(jié)構(gòu)的生物彈性支架而應(yīng)用于乳房組織工程。