微生物藥物的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

饒聰，云軒，虞沂，鄧子新，2

（1 武漢大學(xué)藥學(xué)院，組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430071； 2 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240）

人類使用天然產(chǎn)物作為藥物來預(yù)防、治療疾病已有上千年歷史。天然產(chǎn)物來源非常豐富，其中，微生物來源天然產(chǎn)物是目前開發(fā)臨床抗菌、抗腫瘤、免疫抑制劑等藥物的重要資源，其在農(nóng)業(yè)、食品、軍事等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2000 年以后上市的22 種抗菌藥物中，有12 種來自于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物；而世界藥物市場(chǎng)上約70%的抗生素產(chǎn)品來自于微生物，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生［1］。此外，抗感染藥物青霉素、降膽固醇藥物洛伐他汀、抗真菌藥物棘白霉素和灰黃霉素，以及免疫抑制劑環(huán)孢霉素等臨床一線藥物均來源于真菌，充分顯示了微生物來源天然產(chǎn)物在藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要地位。

自青霉素和鏈霉素相繼被發(fā)現(xiàn)后，20 世紀(jì)50年代至60 年代進(jìn)入到天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的“黃金期”。然而，從20 世紀(jì)90 年代末期開始，傳統(tǒng)的基于生物活性的天然藥物篩選方法導(dǎo)致了大量已知化合物的重復(fù)分離，結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程逐漸放緩，如何有效地靶向分離或者人工創(chuàng)造新型天然藥物已成為微生物天然產(chǎn)物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。2015 年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了天然藥物青蒿素的發(fā)現(xiàn)者中國藥學(xué)家屠呦呦以及阿維菌素發(fā)現(xiàn)者日本科學(xué)家大村智、美國科學(xué)家坎貝爾，正式標(biāo)志著天然產(chǎn)物發(fā)掘進(jìn)入到“新黃金期”。

目前，微生物藥物的研究面臨兩大挑戰(zhàn)：一是超過99%的已知微生物難以在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，即使能被成功培養(yǎng)，大多數(shù)微生物都存在生長速度緩慢、在實(shí)驗(yàn)室條件下編碼天然產(chǎn)物的基因不表達(dá)等問題；二是天然產(chǎn)物生物合成水平較低，野生型菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成水平通常在mg/L 水平或更低，造成了活性天然產(chǎn)物分離鑒定和活性測(cè)定的困難［2］。因此，天然產(chǎn)物生物合成基因簇（BGCs）的體外拼接、異源表達(dá)以及體內(nèi)重組優(yōu)化顯得至關(guān)重要。然而，即使在分子生物學(xué)、代謝組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)快速發(fā)展的今天，對(duì)BGCs進(jìn)行以上操作也絕非易事。被稱為“第三次生物技術(shù)革命”的合成生物學(xué)的興起則大大改變了這一進(jìn)程。合成生物學(xué)是在現(xiàn)代生物學(xué)和化學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)和工程學(xué)、信息學(xué)等多科學(xué)基礎(chǔ)上系統(tǒng)深度交叉融合發(fā)展而來，強(qiáng)調(diào)的是系統(tǒng)化設(shè)計(jì)和工程化構(gòu)建，利用生物系統(tǒng)最基本的DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等作為設(shè)計(jì)元件，再利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝調(diào)控等生物功能把這些基本元件組裝起來，形成生物模塊，最后將這些生物模塊連接成系統(tǒng)，從而獲得重構(gòu)或者非天然的“生物系統(tǒng)”，使生物體按照預(yù)期的方式實(shí)現(xiàn)各項(xiàng)生物學(xué)功能［3］。近20 年來，合成生物學(xué)已在生物能源、生物材料、醫(yī)療技術(shù)以及探索生命規(guī)律等諸多領(lǐng)域取得了令人矚目的成就。本文作者將重點(diǎn)介紹合成生物學(xué)在推動(dòng)微生物藥物發(fā)展中的優(yōu)勢(shì)，并聚焦我國科研工作者近年來運(yùn)用各種合成生物學(xué)技術(shù)在該領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展。

1 合成生物學(xué)技術(shù)為微生物藥物發(fā)展創(chuàng)造新機(jī)遇

截至2020 年3 月，根據(jù)在線基因數(shù)據(jù)庫“GOLD”公布的數(shù)據(jù)，已有3691 種古細(xì)菌、328 612 種細(xì)菌和32 233 種真核生物完成基因組測(cè)序工作［4］。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示，許多微生物基因組所編碼的合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛在基因簇?cái)?shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前已鑒定的天然產(chǎn)物數(shù)，表明微生物天然產(chǎn)物“暗物質(zhì)”是一個(gè)亟待開發(fā)的巨大寶藏，而合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展為挖掘新型天然產(chǎn)物以及創(chuàng)制新型人工產(chǎn)物提供了前所未有的機(jī)遇。一方面，天然產(chǎn)物挖掘的研究策略日趨多樣化，除了經(jīng)典的以酶功能分析為主線的基因組挖掘外，伴隨著合成生物學(xué)興起的生物信息學(xué)和基因編輯技術(shù)，使得大量沉默基因簇得以有效挖掘和激活，新型天然產(chǎn)物的鑒定數(shù)量成爆發(fā)式增長，極大拓展了新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)空間。另一方面，以基因元件（啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、開放閱讀框、終止子等）工程化為理念的合成生物學(xué)技術(shù)，可以用來設(shè)計(jì)與重構(gòu)已有天然產(chǎn)物的生物合成途徑，構(gòu)建和利用通用型底盤細(xì)胞工廠，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)已知化合物骨架的定向改造，創(chuàng)造新型人工產(chǎn)物。下面分別從3個(gè)技術(shù)層面綜述合成生物學(xué)在微生物藥物挖掘方面的優(yōu)勢(shì)。

1.1 生物信息學(xué)分析

目前，已知的大多數(shù)微生物天然產(chǎn)物是通過傳統(tǒng)的基于生物活性篩選的分離方式得到的，這也導(dǎo)致了大量已知化合物的重復(fù)分離。為了解決這一問題，一方面可通過高通量組學(xué)分析（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)），挖掘可能的沉默基因簇；另一方面可基于龐大的數(shù)據(jù)庫，設(shè)計(jì)代謝通路和生物合成途徑，高效異源表達(dá)天然產(chǎn)物［5］。

在挖掘沉默基因簇方面，通用的挖掘平臺(tái)antiSMASH 只是對(duì)單個(gè)基因組進(jìn)行分析，而且依賴于參照數(shù)據(jù)庫的功能注釋［6］。為了對(duì)不同基因組之間的基因簇之間進(jìn)行比較和進(jìn)化分析，BiGSCAPE 則提供了對(duì)大量基因簇序列的相似性聚類分析（biosynthetic gene similarity clustering），結(jié)合基因簇的相似性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行特征挖掘和多樣性比較［7］。但是，以上傳統(tǒng)分析方法并沒有充分發(fā)揮當(dāng)前數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，尤其是基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的深度學(xué)習(xí)技術(shù)在大數(shù)據(jù)中的巨大潛力亟待開發(fā)［8］。隨著人工智能（AI）技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的生物信息學(xué)工具與機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)合，極大地加強(qiáng)了沉默基因簇挖掘的深度，如Tietz 等結(jié)合隱馬爾可夫模型分析、啟發(fā)式打分和機(jī)器學(xué)習(xí)開發(fā)了一個(gè)新型基因組挖掘工具RODEO，成功從已知基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘到超過1300種新型核糖體肽化合物（RiPPs），對(duì)其中6種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)1 種含有類似手銬的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、1種含有罕見的瓜氨酸修飾，該工具的成功開發(fā)為“暗物質(zhì)”的挖掘提供了一個(gè)可借鑒的框架［9］。

在構(gòu)造天然產(chǎn)物人工合成通路和適配性底盤細(xì)胞方面，眾多數(shù)據(jù)庫平臺(tái)和新型工具的開發(fā)使合成生物學(xué)設(shè)計(jì)更加理性和高效，如胡黔楠課題組建立起來的RxnFinder平臺(tái)［10］，集天然產(chǎn)物骨架查找［11］、未知酶反應(yīng)預(yù)測(cè)［12］、生物合成途徑設(shè)計(jì)［13］、細(xì)胞途徑優(yōu)化［14］等功能于一體，是將合成生物學(xué)理念應(yīng)用到微生物藥物開發(fā)領(lǐng)域的強(qiáng)大工具。另外，機(jī)器學(xué)習(xí)也逐漸應(yīng)用在合成代謝系統(tǒng)的改造和設(shè)計(jì)上，并取得了不錯(cuò)的成果。2019 年趙惠民課題組利用集成機(jī)器人系統(tǒng)BioAutomata 與機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，使基于生物系統(tǒng)的“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”流程實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，并已通過優(yōu)化的番茄紅素生物合成途徑驗(yàn)證了其功能［15］。因此，充分利用現(xiàn)有的組學(xué)大數(shù)據(jù)，開發(fā)、拓展、融合其他領(lǐng)域機(jī)器學(xué)習(xí)和數(shù)據(jù)挖掘的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)微生物天然產(chǎn)物的高效自動(dòng)化挖掘，并為搭建高附加值化合物人工合成途徑提供可行方案。

1.2 基因編輯和重組技術(shù)

傳統(tǒng)的細(xì)菌基因工程很大程度上依賴于基于載體質(zhì)粒的單交換或雙交換，這對(duì)于獲得目標(biāo)工程菌株而言費(fèi)時(shí)費(fèi)力。此外，突變株篩選標(biāo)記的選擇與使用也會(huì)帶來不少麻煩。為了克服傳統(tǒng)基因重組技術(shù)的局限性，科學(xué)家們先后利用了包括Cre/loxP、Dre/rox 和Flp/FRT 在內(nèi)的位點(diǎn)特異性重組策略來構(gòu)建基因工程菌株［16］。然而，這些方法都會(huì)保留染色體上的重組酶識(shí)別位點(diǎn)，因此會(huì)限制后續(xù)多次遺傳操作的應(yīng)用。近年來，CRISPRCas9 基因編輯系統(tǒng)快速發(fā)展，在以鏈霉菌為代表的微生物基因工程操作中大顯身手［17］。CRISPRCas9 的基本原理是，Cas9 內(nèi)切酶首先與向?qū)NA（gRNA）形成復(fù)合物，并被引導(dǎo)到一個(gè)與gRNA的間隔序列互補(bǔ)的DNA 序列上，Cas9 隨即誘導(dǎo)基因組DNA雙鏈斷裂（DSB），然后通過非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制修復(fù)DSB［18］，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除、轉(zhuǎn)錄抑制和激活等基因操作。CRISPR-Cas9系統(tǒng)優(yōu)于上述同源重組或位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，因?yàn)樗r(shí)省力，不需要選擇標(biāo)記，也不會(huì)在基因組上留下遺傳標(biāo)記。2015年，Cobb等開發(fā)了一個(gè)工程化的CRISPR-Cas系統(tǒng)pCRISPomyces，用于鏈霉菌菌株的快速多重基因組編輯，在多種鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)了20 bp～30 kb不等的基因缺失，效率達(dá)到70%以上，證明該系統(tǒng)可進(jìn)一步發(fā)展成為細(xì)菌基因組編輯的一個(gè)強(qiáng)大工具［19］。2017 年，Zhang 等利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，以相對(duì)較小的基因組擾動(dòng)策略在基因組中插入啟動(dòng)子，激活了多個(gè)鏈霉菌菌種中不同類型的沉默基因簇，包括I型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS、NRPS、雜合PKS-NRPS和膦酸酯簇，獲得多個(gè)新型天然產(chǎn)物［20］，為新型微生物天然產(chǎn)物的挖掘提供了更為高效的思路和工具。

除基因編輯外，基因組裝配重組技術(shù)也是合成生物學(xué)發(fā)展的前沿領(lǐng)域，目前Red/ET 重組技術(shù)、酵母細(xì)胞內(nèi)同源重組和Gibson一步拼接已發(fā)展成為3 種成熟的基因簇組裝技術(shù)，使得我們可以高效地挖掘和生產(chǎn)天然產(chǎn)物，如2016年山東大學(xué)張友明團(tuán)隊(duì)將Rec/ET 系統(tǒng)和Redαβ 系統(tǒng)整合到同一個(gè)宿主中，通過克隆載體和修飾元件的標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)現(xiàn)了生物合成途徑克隆、轉(zhuǎn)移和異源表達(dá)的無縫對(duì)接［21］。

1.3 底盤細(xì)胞的工程化改造

傳統(tǒng)的微生物藥物開發(fā)，是通過微生物經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)和分離提取來完成的，但是許多能產(chǎn)生有價(jià)值的活性化合物的天然菌株存在難以培養(yǎng)、生長速率慢、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，限制了工業(yè)化生產(chǎn)。隨著DNA 組裝技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，在充分認(rèn)識(shí)微生物藥物合成途徑的前提下，基于合成生物學(xué)原理，可以通過設(shè)計(jì)和改造優(yōu)勢(shì)微生物菌株成為異源高產(chǎn)的底盤細(xì)胞，用于更多活性天然產(chǎn)物的生產(chǎn)。一方面，可以通過在底盤細(xì)胞中重構(gòu)目標(biāo)化合物的生物合成途徑，來激活在原宿主中沉默的生物合成基因簇；另一方面，在合成生物學(xué)的指導(dǎo)下，對(duì)生物原件進(jìn)行重新設(shè)計(jì)、集成和裝配，在底盤細(xì)胞中讓新引入的代謝途徑與宿主原有的代謝路徑進(jìn)行適配，組成全新的代謝網(wǎng)絡(luò)，從而為目標(biāo)產(chǎn)物的合成提供充足的前體供應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富的“非天然”天然產(chǎn)物甚至是人工藥物的定向合成。

為了高效生產(chǎn)微生物天然產(chǎn)物，利用合成生物學(xué)理念對(duì)底盤細(xì)胞進(jìn)行工程化改造的策略通常有3種。第一，基因組精簡和優(yōu)化。采用較小基因組作為底盤細(xì)胞進(jìn)行異源表達(dá)，可減少其他不必要的本底路徑對(duì)底物、能量、還原力的消耗，并降低異源化合物的檢測(cè)和純化難度，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。例如，2019年李永泉課題組等分別敲除了納他霉素的產(chǎn)生菌Streptomyces chattanoogensisL10 中1.3 Mb和0.7 Mb 的非必需基因，得到兩個(gè)底盤細(xì)胞L320和L321，用以高效表達(dá)聚酮天然產(chǎn)物［22］。第二，對(duì)各類調(diào)控因子進(jìn)行改造。微生物底盤細(xì)胞復(fù)雜的生長分化過程以及與之相關(guān)的初級(jí)和次級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)，伴隨著多種調(diào)控因子的調(diào)控，其中既有全局性調(diào)控因子，也有只參與某個(gè)特定產(chǎn)物合成的途徑專一性調(diào)控因子。把這些調(diào)控因子進(jìn)行精確的改造，如敲除、替換和點(diǎn)突變等，可使原有的生物合成基因簇沉默，消除本底代謝產(chǎn)物的影響，從而提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量。例如，2018 年Kallifidas 等通過過表達(dá)Streptomyces albusJ1074 中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP，以及敲除pfk基因等遺傳改造，成功實(shí)現(xiàn)了放線紫紅素的異源表達(dá)［23］。第三，增加前體物供應(yīng)。天然產(chǎn)物異源表達(dá)失敗或產(chǎn)量較低可能是由于宿主內(nèi)缺乏所需底物的合成途徑，要想提高產(chǎn)量，可以通過合成生物學(xué)工程化改造的方法改變宿主的代謝途徑以適應(yīng)異源表達(dá)的需求。例如，2019 年羅小舟等以釀酒酵母為底盤，通過對(duì)底物GPP 合成途徑優(yōu)化以及引入新的大麻素合成酶等工程化改造，成功異源表達(dá)了大麻素及其類似物［24］。這一合成生物學(xué)領(lǐng)域的突破性進(jìn)展為大麻素的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也為其他高附加值天然藥物的異源表達(dá)提供了重要的借鑒。

2 合成生物學(xué)在微生物藥物研究中的應(yīng)用

天然產(chǎn)物一直是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源，但20 世紀(jì)80 年代興起的組合化學(xué)和高通量篩選技術(shù)，使傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)受到冷落，許多大型制藥公司大幅裁減了基于天然產(chǎn)物藥物挖掘的項(xiàng)目，主要原因有兩個(gè)：一是傳統(tǒng)技術(shù)與方法發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物骨架有限；二是天然產(chǎn)物在鑒定、純化、合成和規(guī)?；a(chǎn)等方面存在重大技術(shù)挑戰(zhàn)。進(jìn)入21世紀(jì)，高通量基因組測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展及分子生物學(xué)操作技術(shù)的日趨成熟為開發(fā)新的天然產(chǎn)物發(fā)掘方法創(chuàng)造了條件，特別是合成生物學(xué)概念與相關(guān)技術(shù)的快速崛起，使科學(xué)家們可以高通量分析、預(yù)測(cè)未知化合物的骨架結(jié)構(gòu)，也可以設(shè)計(jì)和改造合適的底盤細(xì)胞，從而提高已知化合物的產(chǎn)量以及獲得更多結(jié)構(gòu)修飾的新化合物。這一理念先后在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［25］和抗瘧化合物青蒿素［26］的開發(fā)中獲得成功，并在更多微生物天然藥物研究中大放異彩。

2.1 氨基糖苷類抗生素

作為曾經(jīng)治療細(xì)菌感染的一線臨床藥物，氨基糖苷類抗生素在人類與病原微生物的抗?fàn)幹凶鞒隽司薮筘暙I(xiàn)。雖然這一大類藥物一直以來因其耳毒性和腎毒性等毒副作用而頗受詬病，并且因其日益嚴(yán)重的耐藥性而受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，但借助合成生物學(xué)能使這些經(jīng)典“老藥”煥發(fā)新的活力［27］。

慶大霉素是氨基糖苷類代表性化合物，臨床上曾經(jīng)是治療由革蘭氏陰性菌所引發(fā)嚴(yán)重感染的首選藥物。慶大霉素骨架上復(fù)雜多樣的甲基化和氨基化修飾與其生物活性密切相關(guān)，也是其耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元。孫宇輝課題組從單基因功能的探究到多基因網(wǎng)絡(luò)的解析，全面揭示了慶大霉素甲基化立體交叉代謝網(wǎng)絡(luò)，為慶大霉素復(fù)雜多組分的產(chǎn)生提供了合理的解釋，更重要的是為定向產(chǎn)生高效低毒的慶大霉素單組分提供了一張清晰的代謝線路圖［28］。西索米星是慶大霉素的結(jié)構(gòu)類似物，但性能上大大優(yōu)于后者，孫宇輝課題組近來開發(fā)了一種將CRISPR-Cas9系統(tǒng)與體外λ包裝系統(tǒng)相結(jié)合的克隆方法，成功用于西索米星合成基因簇的靶向克?。?0.7 kb），為后續(xù)西索米星的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)［29］。這種基因簇克隆的新穎方法普適性好，有望廣泛應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物途徑的高效克隆。

C7N氨基環(huán)醇β-valienamine和valienamine是用于開發(fā)新型生物活性β-糖苷酶抑制劑的平臺(tái)化合物， 由于結(jié)構(gòu)中存在多手性中心，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)全合成非常困難。馮雁課題組和白林泉課題組利用來自圓形芽孢桿菌（Bacillus circulans）的具有立體選擇特異性的異源氨基轉(zhuǎn)移酶BtrR，設(shè)計(jì)了β-valienamine的人工合成途徑并實(shí)現(xiàn)了在井岡霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌5008（Streptomyces hygroscopicus5008）衍生菌株中的生產(chǎn)［30］。接著，他們運(yùn)用蛋白質(zhì)進(jìn)化技術(shù)，將來自大腸桿菌的BtrR 同工酶WecE 改造成活性提高了32.6 倍的突變體酶蛋白VarB，并將兩個(gè)拷貝的varB基因引入吸水鏈霉菌5008 衍生菌株，實(shí)現(xiàn)了一步法發(fā)酵產(chǎn)生valienamine（圖1）［31］。這項(xiàng)工作通過合成生物學(xué)的理念建立了快速生產(chǎn)β-valienamine 和valienamine 的途徑，大大簡化了常規(guī)生產(chǎn)時(shí)所涉及的有效霉素A 合成和降解的多個(gè)生物合成步驟。

α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖是由放線菌Actinoplanessp.SE50/110產(chǎn)生的治療2型糖尿病的主要藥物。阿卡波糖的生物合成途徑一直未被清晰揭示，嚴(yán)重阻礙了在產(chǎn)生菌中提升其發(fā)酵效價(jià)。近日，白林泉課題組發(fā)現(xiàn)化合物1-epi-valienol 和valienol是阿卡波糖合成途徑的旁支產(chǎn)物，并在發(fā)酵液中大量累積，這是由于氨基脫氧己糖單元合成不充分造成的。在此基礎(chǔ)上，該課題組改造了阿卡波糖的代謝通路，減少旁支產(chǎn)物的同時(shí)，提高了氨基脫氧己糖這一前體物的合成量，最終將阿卡波糖的產(chǎn)量提升至7.4g/L［32］。這項(xiàng)工作也證明，利用合成生物學(xué)的理念和手段，可以將已有的合成途徑進(jìn)行理性改造，從而大幅提高天然藥物效價(jià)。

2.2 核苷類抗生素

核苷類化合物結(jié)構(gòu)獨(dú)特，臨床上許多用于治療病毒感染性疾病的藥物以及農(nóng)業(yè)上用于生物防治植物病蟲害的抗生素都來自于這個(gè)家族。核苷類抗生素的生物合成邏輯并不復(fù)雜，一般是通過簡單的堿基模塊構(gòu)建復(fù)雜的分子，但合成過程涉及許多復(fù)雜的多酶反應(yīng)。近年來，核苷類抗生素生物合成領(lǐng)域取得了多項(xiàng)突破，為通過合成生物學(xué)針對(duì)性地制造人工設(shè)計(jì)的核苷類藥物鋪平了道路［33］。陳文青課題組發(fā)現(xiàn)并解析了多氧霉素（polyoxin）中氨甲酰基聚草氨酸（carbamoyl poly-oxamic acid，CPOAA） 的生物合成途徑，并體外重構(gòu)了CPOAA 的生物合成途徑，豐富了核苷類抗生素可編輯的合成元件［34］。同時(shí)，他們解析了多氧霉素核苷骨架C-5 特殊的甲基化修飾［35］和噴司他?。╬entostatin， PTN）以及維達(dá)拉濱（vidarabine，Ara-A）C-2 羥基的異構(gòu)化［36］，為核苷類抗生素的體外改造提供了參考。他們還解析了間型甲霉素（formycin A， FOR-A）和吡唑呋啉（pyrazofurin A， PRF-A）等嘌呤相關(guān)的C-核苷類抗生素核糖與吡唑衍生物的堿基C-糖苷鍵的催化基礎(chǔ)［37］，以及結(jié)核菌素（tubercidin， TBN）等核苷類似物嘌呤與糖苷的N-糖苷鍵連接途徑［38］。這些核苷類抗生素的組裝邏輯的闡明不僅為進(jìn)一步了解相關(guān)核苷類抗生素的生物合成提供了酶學(xué)基礎(chǔ)，而且有助于通過合成生物學(xué)策略合理設(shè)計(jì)更多的雜合核苷類抗生素。最近，他們報(bào)道了一種靶向基因組挖掘方法，尋找并表征了海口小單孢菌DSM 45626 和檸檬色鏈霉菌NBRC 13005 中嘌呤核苷類抗生素芒霉素（aristeromycin， ARM）和助間型甲霉素（coformycin， COF）的生物合成途徑，為合理尋找嘌呤類抗生素開辟了新的途徑（圖2）［39］。

以上研究結(jié)果闡明了多個(gè)核苷類抗生素的生物合成途徑以及組裝邏輯，豐富了該家族可編輯的合成元件，并找到多處核苷類抗生素可修飾位點(diǎn)，有助于將來通過合成生物學(xué)策略定向設(shè)計(jì)多修飾位點(diǎn)的雜合核苷類抗生素。

圖1 Valienamine天然多步合成途徑及改造后的簡化合成途徑Fig.1 The natural multistep biosynthetic pathway of valienamine,and the simplified biosynthetic pathway after modification

圖2 嘌呤核苷類抗生素的靶向基因組挖掘Fig.2 Targeted genome mining of purine nucleoside antibiotics

2.3 核糖體肽

核糖體肽是一大類具有高度結(jié)構(gòu)多樣性和多種生物活性的天然產(chǎn)物。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20 多個(gè)不同的核糖體肽家族，每個(gè)家族都具有獨(dú)特的化學(xué)特征［40］。硫肽類抗生素是一類富含元素硫、結(jié)構(gòu)被高度修飾的核糖體肽，具有包括抗感染、抗腫瘤和免疫抑制等在內(nèi)的一系列重要生物活性。因此，對(duì)硫肽類的生物合成研究有助于理解肽或蛋白質(zhì)的復(fù)雜翻譯后修飾過程，并能指導(dǎo)開發(fā)新的肽類藥物［41］。那西肽（nosiheptide）是最早被解析生物合成途徑的核糖體肽之一，近年來，劉文課題組解析了一類自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）甲基轉(zhuǎn)移酶NosN 的功能， 該酶除了催化甲基轉(zhuǎn)移，還可以通過功能化S偶聯(lián)的吲哚部分以選擇性地構(gòu)建一碳單元，與硫肽骨架形成酯鍵并建立nosiheptide特有的側(cè)環(huán)系統(tǒng)，來轉(zhuǎn)化聚噻唑基肽中間體［42］。同時(shí)，劉文課題組還解析了硫肽類抗生素的中央哌啶雜環(huán)的生物合成［43］，這一成果極大地豐富了核糖體肽的合成和修飾元件。硫鏈絲菌素（thiostrepton，TSR）和鹽屋霉素（siomycin，SIO）也都是硫肽抗生素重要代表，可有效拮抗多種革蘭氏陽性細(xì)菌，并已被用作動(dòng)物抗菌劑使用?；赥SR 與原核病原體的構(gòu)效關(guān)系，劉文課題組構(gòu)建了一個(gè)新型硫肽化合物組合合成平臺(tái)，得到了經(jīng)喹啉酸（quinaldic acid，QA）修飾的SIO 類似物，并生成了一個(gè)新的SIO 衍生物5'-氟-SIO，其水溶性相比天然硫肽化合物有很大改善，且抗菌活性超過TSR，這為利用合成生物學(xué)策略改造現(xiàn)有核糖體肽的理化性質(zhì)提供了新思路［44］（圖3）。

除了硫肽類化合物，其他核糖體肽家族化合物的研究也正如火如荼地進(jìn)行。張琪課題組以cypemycin 為模型，分析了前體肽成熟所涉及的構(gòu)效關(guān)系，生成了一系列新的cypemycin 突變體，其中T2S 突變體表現(xiàn)出對(duì)微球菌的活性增強(qiáng)［45］。這項(xiàng)研究凸顯了運(yùn)用基因組挖掘和合成生物學(xué)技術(shù)探索核糖體肽的潛力。

圖3 喹啉酸及其類似物喂養(yǎng)工程菌SL3052產(chǎn)生siomycin及其類似物Fig.3 The engineered strain SL3052 fed with quinolinic acid and its analogues,leading to the production of siomycin and its analogues

2.4 萜類

萜類是自然界中最為豐富的一類化合物，在生物醫(yī)藥、能源、食品和化妝品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，著名的青蒿素和紫杉醇都屬于這一大家族。時(shí)至今日，研究人員對(duì)萜類化合物生物合成元件的挖掘還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。為此，劉天罡課題組對(duì)絲狀真菌來源的I型萜類環(huán)化酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)第三個(gè)進(jìn)化分支（Clade Ⅲ）上的萜類環(huán)化酶具有底物及反應(yīng)雜泛性的潛質(zhì)。隨后，該課題組在前期對(duì)萜類化合物“定向合成代謝”深刻認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)含有3個(gè)不同模塊（底物供給模塊、不同異戊二烯前體合成模塊、萜類合酶模塊）的萜類化合物組合生物合成平臺(tái)，研究兩個(gè)位于Clade Ⅲ分支的萜類環(huán)化酶FgMS 和FgGS 合成萜類化合物的潛力。結(jié)果顯示，它們能夠合成多達(dá)50 種單萜、倍半萜、二萜以及二倍半萜化合物，其中包含3個(gè)全新骨架，從而證明了上述萜組合生物合成平臺(tái)的有效性與高效性［46］。維生素E是全球市場(chǎng)容量最大的維生素類產(chǎn)品之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有萜結(jié)構(gòu)單元，一直以來，工業(yè)上依靠化學(xué)法對(duì)其進(jìn)行合成。劉天罡課題組與能特科技公司合作，采用微生物發(fā)酵合成的法尼烯為中間體來合成維生素E 前體——異植物醇， 進(jìn)而合成維生素E，顛覆了國外壟斷數(shù)十年的化學(xué)全合成技術(shù)，為萜類藥物的生物合成提供了新思路。

釀酒酵母是天然化合物生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)異源宿主，然而，它對(duì)親脂性天然產(chǎn)物，特別是在細(xì)胞內(nèi)積累的化合物，例如聚酮化合物和類胡蘿卜素，顯示出有限的產(chǎn)量。劉天罡課題組將谷氨酸鐮刀菌中的倍半萜烯合酶FgJ03939在釀酒酵母底盤中得到充分利用，以生產(chǎn)新型倍半萜品鐮刀菌二烯、表-巖藻糖醇、巖藻糖醇和5/7、5/6/3三環(huán)系統(tǒng)以及5個(gè)已知的倍半萜，這極大豐富了萜類化合物可編輯的合成元件［47］（圖4）。趙廣榮課題組重建了正交檸檬烯生物合成（orthogonal limonene biosynthetic， OLB）途徑，該途徑引入NPP合成酶編碼基因SlNDPS1，從而實(shí)現(xiàn)了將IPP 和DMAPP 轉(zhuǎn)化為NPP（cis-GPP），再由植物來源的檸檬烯合成酶催化NPP轉(zhuǎn)化為檸檬烯。結(jié)果顯示，正交檸檬烯生物合成途徑能比傳統(tǒng)檸檬烯生物合成途徑更加有效地生產(chǎn)檸檬烯，當(dāng)感應(yīng)葡萄糖的啟動(dòng)子HXT1（PHXT1）在染色體水平調(diào)控競爭基因ERG20的表達(dá)時(shí)，攜帶正交檸檬烯生物合成途徑的菌株在補(bǔ)料分批發(fā)酵中可產(chǎn)生917.7 mg/L的檸檬烯，比傳統(tǒng)檸檬烯生物合成途徑增加6倍，是目前報(bào)道的最高產(chǎn)量［48］。在釀酒酵母生成萜類化合物研究中，正交工程策略正展現(xiàn)出巨大的潛力。

目前，利用合成生物學(xué)構(gòu)建的人工合成體系通常不具備天然催化體系中酶的高度組織性，由此會(huì)大大降低整體的催化效率，并會(huì)導(dǎo)致代謝流不平衡。為解決這一難題，劉天罡課題組和夏江課題組開發(fā)了一種人工蛋白骨架結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)基于一對(duì)簡單的多肽相互作用標(biāo)簽RIAD 和RIDD，RIDD 會(huì)自發(fā)形成生理?xiàng)l件穩(wěn)定的二聚體，RIAD則會(huì)進(jìn)一步與RIDD二聚體結(jié)合，形成穩(wěn)定的三聚結(jié)構(gòu)，通過在目的蛋白上分別融合表達(dá)這一對(duì)多肽標(biāo)簽，就能實(shí)現(xiàn)原本存在物理分割的代謝通路的鏈接，使人工合成體系運(yùn)轉(zhuǎn)得更為高效［49］。作者將這一技術(shù)運(yùn)用到萜類化合物蝦青素和類胡蘿卜素的生物合成中，在底盤細(xì)胞中對(duì)萜類合成前體的代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了精準(zhǔn)組裝進(jìn)而匯聚代謝流，成功實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)。這項(xiàng)工作證實(shí)，通過人工蛋白骨架結(jié)構(gòu)可以將目標(biāo)化合物的關(guān)鍵合成節(jié)點(diǎn)進(jìn)行連接，從而解決底物傳遞以及代謝流不平衡等問題，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子產(chǎn)量的提升。毫無疑問，人工蛋白骨架技術(shù)是未來合成生物學(xué)的一大熱點(diǎn)，將在更多更為復(fù)雜的生物體系中得到應(yīng)用。

2.5 聚酮化合物

阿維菌素等具有重要藥用價(jià)值的聚酮化合物是放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要在發(fā)酵罐中菌體生長的穩(wěn)定期產(chǎn)生，而聚酮化合物生物合成的細(xì)胞內(nèi)代謝物源頭一直未有定論。近來，王為善課題組、張立新課題組和向文勝課題組聯(lián)手，通過控制細(xì)胞內(nèi)三酰甘油（TAG）的代謝流大幅提高了鏈霉菌多聚酮的效價(jià)。研究人員首先運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在菌體的初級(jí)代謝中，胞內(nèi)積累的TAG在穩(wěn)定期會(huì)降解，這一過程將導(dǎo)致碳代謝從胞內(nèi)TAG和胞外底物的合成流向聚酮化合物的生物合成?；谶@一發(fā)現(xiàn)，研究人員設(shè)計(jì)了一種名為“TAG 的動(dòng)態(tài)降解”（ddTAG）的策略，提高了天藍(lán)色鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、緣條鏈霉菌和阿維鏈霉菌中放線菌素、杰多霉素B、土霉素和阿維菌素B1a 的滴度，尤其將ddTAG應(yīng)用到180 t工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中，可將阿維菌素B1a的效價(jià)提高到9.31 g/L，這也是迄今為止阿維菌素的最高發(fā)酵效價(jià)［50］。

圖4 釀酒酵母中萜類化合物合成通路Fig.4 The synthesis pathway of terpenoids in Saccharomyces cerevisiae

另一個(gè)通過改變前體供應(yīng)代謝流來提高聚酮類藥物發(fā)酵產(chǎn)量的例子是紅霉素。紅霉素的生物合成通常是以丙酰輔酶A 為直接前體，但丙酰輔酶A 的過量供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致高丙酰化引起的反饋抑制，從而影響紅霉素的發(fā)酵。為解決這一問題，葉邦策課題組開發(fā)了一種能解除丙?；D(zhuǎn)移酶引起的反饋抑制來提高細(xì)胞中丙酰輔酶A 供應(yīng)的策略，結(jié)果顯示，基因工程菌株中紅霉素產(chǎn)量比工業(yè)高產(chǎn)菌株Ab 高出22%［51］。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)揭示了蛋白質(zhì)?；诳股睾铣汕绑w供應(yīng)中的作用，并為應(yīng)用合成生物學(xué)提升次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供了有效的翻譯后修飾策略（PTM-ME）。

3 微生物藥物合成生物學(xué)面臨的挑戰(zhàn)與展望

進(jìn)入21 世紀(jì)以來，高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了海量微生物基因組數(shù)據(jù)，初步的生物信息學(xué)分析顯示，微生物基因組理論上編碼的次級(jí)代謝產(chǎn)物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于從這些微生物中已分離得到的化合物，暗示已知天然產(chǎn)物相對(duì)于大自然“暗物質(zhì)”化合物庫而言僅僅是冰山一角。雖然以antiSMASH、BiG-SCAPE 等為代表的“基因組掃描” 技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)成功挖掘出許多新型天然產(chǎn)物，但是，這些分析工具需要借助已知生物合成途徑作參考，且往往依賴于研究人員的經(jīng)驗(yàn)判斷，無法捕獲基因組信息與合成產(chǎn)物之間的高階信息，從而限制了其發(fā)現(xiàn)新化合物合成途徑的能力。因此，更加先進(jìn)智能的天然產(chǎn)物合成途徑預(yù)測(cè)工具，尤其是基于已有生物合成途徑的人工智能深度學(xué)習(xí)的大數(shù)據(jù)分析方法亟待開發(fā)和運(yùn)用。

獲得了可能編碼天然產(chǎn)物的基因簇后，還需要置于合適的微生物細(xì)胞工廠中表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)潛在天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征和活性測(cè)試。然而，由于人類對(duì)生物體系的認(rèn)知還十分有限，當(dāng)前基于合成生物學(xué)設(shè)計(jì)的底盤細(xì)胞代謝途徑并不能完全發(fā)揮預(yù)期的功能，還需要深入研究微生物初級(jí)代謝和次級(jí)代謝之間的關(guān)系和調(diào)控機(jī)制，為構(gòu)建適合高產(chǎn)不同種類化合物的優(yōu)質(zhì)底盤細(xì)胞提供理論支撐。另外，由于目前龐大的基因組數(shù)據(jù)庫已經(jīng)超出了傳統(tǒng)化合物挖掘的能力，利用機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)生物系統(tǒng)“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”流程完全自動(dòng)化，可使我們避免浪費(fèi)過多的時(shí)間在無謂的嘗試上，提高微生物藥物挖掘和生產(chǎn)的效率。

綜上所述，我國近五年來在微生物藥物合成生物學(xué)領(lǐng)域取得了多項(xiàng)突破性進(jìn)展，但仍然與歐美頂尖合成生物學(xué)研究團(tuán)隊(duì)存在差距。隨著病原菌耐藥性的日益加重，以及新型疾病的不斷出現(xiàn)［如2019 年底爆發(fā)的2019 冠狀病毒?。–OVID-19）等］，我國生物藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展正面臨著自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)藥物品種匱乏、品質(zhì)提高和規(guī)?；a(chǎn)等諸多方面的難題和機(jī)遇，而合成生物學(xué)則是促成我國生物藥物產(chǎn)業(yè)超常規(guī)發(fā)展的核心動(dòng)力。我們要繼續(xù)在天然藥物資源挖掘、合成基因元件庫搭建、藥物人工合成體系深度優(yōu)化、高效基因編輯技術(shù)開發(fā)、酶蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)與分子進(jìn)化等方向開展研究，并積極布局合成生物學(xué)前沿，包括生物傳感器（biosensors）、基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)模型（genome-scale metabolic models）、基于生物的化學(xué)地圖（bio-based chemicals map）等［52］，最終實(shí)質(zhì)性加強(qiáng)基礎(chǔ)研究與工業(yè)化生產(chǎn)的深入對(duì)接，系統(tǒng)整合各方實(shí)力，建立我國從上游到下游，從源頭到產(chǎn)品的系統(tǒng)性和可持續(xù)的藥物研發(fā)體系，徹底變革小分子藥物的創(chuàng)制模式，實(shí)現(xiàn)我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的源頭創(chuàng)新和轉(zhuǎn)型升級(jí)。