基因密碼子拓展技術(shù)的方法原理和前沿應(yīng)用研究進(jìn)展

付憲，林濤，張帆，張惠銘，章文蔚，楊煥明，4，朱師達(dá)，5，徐訊，沈玥，5，6

（1 深圳華大生命科學(xué)研究院，廣東 深圳 518083； 2 廣東省高通量基因組測序與合成編輯應(yīng)用重點實驗室，深圳華大生命科學(xué)研究院，廣東 深圳 518120； 3 中國科學(xué)院大學(xué)華大教育中心，廣東 深圳 518083； 4 （廣東?。┤A大基因合成基因組學(xué)院士工作站， 深圳華大基因科技有限公司，廣東 深圳 518120； 5 深圳創(chuàng)新分子診斷技術(shù)工程實驗室，深圳華大生命科學(xué)研究院，廣東 深圳 518120； 6 深圳國家基因庫，廣東 深圳 518120）

遺傳密碼（決定DNA 中三個核苷酸為一組的密碼子轉(zhuǎn)譯為蛋白質(zhì)中氨基酸序列的規(guī)則）曾被認(rèn)為是不可改變的，且可被基因編碼的氨基酸種類局限于20 種。隨后的研究打破了這一結(jié)論，表明生物的遺傳密碼在不同物種間也存在一定的差異性。例如，在釀酒酵母的線粒體中，終止密碼子UGA 也能編碼色氨酸［1］。在包括人類在內(nèi)的許多物種中，UGA 亦可被用于編碼常規(guī)氨基酸之外的第21 種氨基酸，即硒代半胱氨酸［2］。這些發(fā)現(xiàn)均暗示著遺傳密碼在生物體內(nèi)具有可拓展和被重編的潛力。

受到自然界中密碼子重編案例的啟示，在過去的20 多年中，研究人員基于對中心法則的理解運用，成功開發(fā)出在生物體內(nèi)進(jìn)行密碼子拓展的方法，實現(xiàn)了常規(guī)20 種氨基酸以外的非天然氨基酸的編碼。除β-氨基酸和D-α-氨基酸外，非天然氨基酸還包括針對特殊氨基酸側(cè)鏈基團（R）設(shè)計改造的氨基酸。這樣的設(shè)計改造能極大地拓展天然編碼系統(tǒng)中有限的蛋白質(zhì)構(gòu)筑基元種類，對精細(xì)改造或調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能將起到重要的作用。

基因密碼子拓展技術(shù)的開發(fā)優(yōu)化主要圍繞翻譯工具和適配底盤細(xì)胞兩部分。開發(fā)高效且正交的翻譯工具，使其既能特異性識別非天然氨基酸又能與生物內(nèi)源的翻譯系統(tǒng)兼容，從而保證目標(biāo)蛋白質(zhì)合成過程的正交性。構(gòu)建適配的底盤細(xì)胞，需要改造細(xì)胞基因組使其具有被翻譯工具識別的空白密碼子，并對翻譯系統(tǒng)等諸多細(xì)胞途徑進(jìn)行后續(xù)改造，從而保證遺傳信息傳遞和解讀過程的正交性。借助正交的翻譯工具和適配底盤細(xì)胞，基因密碼子拓展技術(shù)可實現(xiàn)將特殊用途的非天然氨基酸定點引入到目標(biāo)蛋白的指定位點，為人類在醫(yī)藥、健康、能源、材料等多個重要領(lǐng)域的發(fā)展注入新的活力。本文作者將從翻譯工具和適配底盤的開發(fā)兩方面展開，系統(tǒng)討論基因密碼子拓展技術(shù)的發(fā)展，并介紹其在科研與產(chǎn)業(yè)中的相關(guān)應(yīng)用。

1 密碼子拓展系統(tǒng)的翻譯工具

自然界生物按照其對應(yīng)的密碼子表來基因編碼蛋白質(zhì)合成所需的20 種天然氨基酸（不包括硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸）。在生物體內(nèi)，如磷酸化、乙?；?、泛素化等翻譯后修飾是豐富天然氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)而拓展蛋白質(zhì)功能的主要途徑，在許多生命過程的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。蛋白質(zhì)氨基酸種類的拓展亦可以通過向目標(biāo)蛋白中引入非天然氨基酸的方式來實現(xiàn)。技術(shù)手段包括往細(xì)胞中注射化學(xué)合成的氨?；痶RNA［3］，或改造營養(yǎng)缺陷型菌株使其可利用氨基酸類似物［4］。此外，以Peter G.Schultz等為代表的研究人員開發(fā)了一種基因密碼子拓展方法，通過往細(xì)胞內(nèi)引入改造后的翻譯工具來實現(xiàn)基因編碼非天然氨基酸，為拓展蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能開辟了新的路徑［5］。密碼子拓展技術(shù)的核心是需要引入一套正交的外源翻譯工具，即能特異性識別非天然氨基酸的氨酰-tRNA 合成酶以及能識別空白密碼子的配對tRNA［圖1（a）］。同時，該工具配對不能與宿主細(xì)胞中的內(nèi)源性氨酰-tRNA 合成酶或tRNA 發(fā)生交叉反應(yīng)［圖1（b）］。此外，通過對其他核心翻譯元件（如延伸因子和核糖體）進(jìn)行設(shè)計和改造，可進(jìn)一步實現(xiàn)對密碼子拓展系統(tǒng)的優(yōu)化，從而提高非天然氨基酸被特異性地引入到目標(biāo)蛋白中的效率［6-8］。本節(jié)將重點圍繞以氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對為代表的翻譯元件正交性以及多種其他翻譯元件的改造方法進(jìn)行介紹討論。

1.1 氨酰-tRNA合成酶/tRNA配對的正交性

氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對是翻譯過程中的核心工具，保證其正交性是進(jìn)行技術(shù)開發(fā)和相應(yīng)下游應(yīng)用挖掘的關(guān)鍵。氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對的正交性包含兩個層面：第一，tRNA 的正交性，即外源引入的工具tRNA（用于匹配空白密碼子的tRNA）只能被對應(yīng)的工具酶特異性地識別，而不能與內(nèi)源的其他氨酰-tRNA合成酶發(fā)生交叉反應(yīng)；第二，氨酰-tRNA合成酶的正交性，即外源的氨酰-tRNA合成酶工具能特異性地識別外源添加的非天然氨基酸［圖1（b）］［6-8］。

1.1.1 tRNA的正交性

tRNA 是翻譯過程中氨基酸的運輸工具，每種tRNA 上帶有的被對應(yīng)氨酰-tRNA 合成酶所識別的特征元素決定了tRNA 水平的正交性［9］。理想的正交氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對不會與宿主細(xì)胞中的天然氨基酸、內(nèi)源性氨酰-tRNA 合成酶或tRNA發(fā)生交叉反應(yīng)。早期研究通過對內(nèi)源的氨酰-tRNA合成酶和配對tRNA 進(jìn)行設(shè)計改造，成功開發(fā)出在tRNA 水平正交的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對，使其能獨立于內(nèi)源的工具配對行使特定的功能［10］。另一種思路則是從進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的生物體中選擇氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對進(jìn)行改造，以降低交叉反應(yīng)的發(fā)生概率。例如，古菌Methanococcus janaschii的酪氨酰-tRNA 合成酶/酪氨酸t(yī)RNA 配對（MjTyrRS/tRNATyr）于2001 年被引入到大腸桿菌中，用于編碼合成含有O-甲基-L-酪氨酸的蛋白質(zhì)［11］。在大腸桿菌中選擇上述工具配對的原因包括：①MjtRNATyr的氨基酸接納莖上第一個堿基對為C-G（大腸桿菌是G-C），可有效地防止被內(nèi)源TyrRS 酶識別［12］；②TyrRS 不具有對于底物氨基酸的編輯校對機制［13］，有益于非天然氨基酸的引入。這些特征極大地降低了正交工具改造的難度，且改造后的MjTyrRS/tRNACUA配對因在大腸桿菌中具有良好的正交性和較高的活性，得到了廣泛的應(yīng)用［14］。然而，該工具配對在酵母和哺乳細(xì)胞等真核系統(tǒng)中不正交，該配對在真核系統(tǒng)中的應(yīng)用則受到了限制?；谙嗨圃?，可用于真核系統(tǒng)的多個氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對被相繼開發(fā)出來。例如，源自大腸桿菌的酪氨酰-tRNA 合成酶/酪氨酸t(yī)RNA 配對（EcTyrRS/tRNACUA）和亮氨酰-tRNA 合 成 酶/亮 氨 酸t(yī)RNA 配 對（EcLeuRS/tRNACUA）被改造為真核生物中的密碼子拓展工具［15-19］，但由于這些配對工具在大腸桿菌中和一些其他細(xì)菌中不正交，故又不適用于原核系統(tǒng)。

吡咯賴氨酰-tRNA 合成酶/吡咯賴氨酸t(yī)RNA 配對（PylRS/tRNAPyl）存在于一些產(chǎn)甲烷的古菌和細(xì)菌中，是編碼吡咯賴氨酸（第22 種氨基酸）的工具。因其在多種生物系統(tǒng)中（包括細(xì)菌和真核生物）都具有高正交性，適合作為在原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)中的通用性密碼子拓展工具進(jìn)行改造。針對tRNAPyl的正交性維持機制已積累了較為全面的研究基礎(chǔ)：通過體內(nèi)活性和氨酰動力學(xué)測試，tRNAPyl的氨基酸接納莖中G73 位點和第一個堿基對以及T 環(huán)堿基對G51：C63 是重要的識別特征元素［20］。PylRS 酶氮末端結(jié)構(gòu)域緊密地貼合在由tRNAPyl的T 環(huán)和極小可變環(huán)組成的凹面上，這一結(jié)構(gòu)特征使得PylRS/tRNAPyl配對自身能夠特異性結(jié)合，且能避免其他內(nèi)源tRNA 中較長可變環(huán)與PylRS酶的非特異性結(jié)合［21］。此外，PylRS酶具有氨基酸底物識別可塑性高和不識別tRNA 反密碼子環(huán)等優(yōu)良特性，進(jìn)一步促使PylRS/tRNACUA配對成為目前應(yīng)用范圍最廣泛的編碼工具［20］。

圖1 密碼子拓展系統(tǒng)的翻譯工具示意圖Fig.1 Orthogonal translational tools for genetic code expansion

開發(fā)在tRNA 水平相互正交的編碼工具是同時基因編碼多種非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，也是該領(lǐng)域備受關(guān)注的研究方向。早期研究的關(guān)注點在于將一種非天然氨基酸引入到蛋白質(zhì)合成中，隨著近年來新型工具配對的開發(fā)和的優(yōu)化方法的改進(jìn)，在目標(biāo)蛋白質(zhì)中同時基因編碼2～3 種非天然氨基酸已成為可能［22-23］。在細(xì)胞中編碼多種非天然氨基酸合成的蛋白質(zhì)，需要借助相互正交的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對實現(xiàn)。即在不與內(nèi)源的翻譯系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)的前提下，引入的多對外源氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對之間亦不能發(fā)生相互作用［圖1（b）］［8］。一些已開發(fā)的用于編碼非天然氨基酸的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 工具配對自身已經(jīng)具備相互正交性。例如，古菌來源的MjTyrRS/tRNACUA和PylRS/tRNAPyl配對（tRNAPyl被改造用于抑制終止密碼子UAA）可分別將2 種非天然氨基酸同時引入大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶中［24］。進(jìn)一步配合大腸桿菌衍生工具配對EcTrpRS/tRNA，則可實現(xiàn)同時基因編碼3 種不同的非天然氨基酸［22］。近年來，海量的基因組與宏基因組數(shù)據(jù)成為開發(fā)新型氨酰-tRNA 合成酶/tRNA的重要資源，通過生物信息學(xué)的深度分析挖掘，一些新型的PylRS/tRNAPyl配對被挖掘和發(fā)現(xiàn)，可用于開發(fā)同類型相互正交的非天然氨基酸編碼工具［25-27］。

1.1.2 氨酰-tRNA合成酶的正交性

作為細(xì)胞中最古老的酶之一，氨酰-tRNA合成酶是保證翻譯過程嚴(yán)格按照遺傳密碼子表執(zhí)行的核心元件。通過長期的進(jìn)化，氨酰-tRNA合成酶中氨基酸結(jié)合口袋這一特定結(jié)構(gòu)能特異性地識別對應(yīng)的氨基酸，從而保證氨酰-tRNA合成酶對底物的正交性。因此，開發(fā)能特異性識別非天然氨基酸的工具酶需要對氨酰-tRNA合成酶中氨基酸結(jié)合口袋及其他關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域進(jìn)行設(shè)計改造和定向進(jìn)化。基于上述思路和策略，不同類型的氨酰-tRNA合成酶被用于改造，多種用于基因密碼子拓展的工具酶被成功地開發(fā)出來，實現(xiàn)了把超過200種的非天然氨基酸特異性地引入到生物體蛋白中［28-29］。例如，包含β-芳香族側(cè)鏈或γ-芳香族側(cè)鏈的非天然氨基酸可通過改造MjTyrRS 酶引入［30］；特異性改造EcLeuRS 酶可實現(xiàn)O-甲基-L-酪氨酸、α-氨基辛酸以及光敏感的鄰硝基芐基半胱氨酸等的引入［19］。

當(dāng)討論氨酰-tRNA合成酶工具用于密碼子拓展的有效性和可行性時，其底物水平的正交性是相對而非絕對的。即相比上文提到的“一對一”識別特異性的案例，還存在“一對多”識別的情況。一些氨酰-tRNA 合成酶存在底物多特異性（polyspecific），能夠同時識別多種天然或者非天然氨基酸［31］。例如，野生型的PylRS 可識別超過20種賴氨酸衍生物［32］，改造后可實現(xiàn)特異性地識別N-乙?；嚢彼峒捌溲苌锘蛘邘в兄咀鍌?cè)鏈的非天然氨基酸［29，31］。多特異性現(xiàn)象的存在可能是氨酰-tRNA合成酶在進(jìn)化過程中缺乏同類型氨基酸底物的競爭所致，該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對應(yīng)用某些廉價氨基酸衍生底物進(jìn)行酶活性測試和定向進(jìn)化相關(guān)研究有著重要的意義。

1.2 氨酰-tRNA合成酶/tRNA配對的改造

開發(fā)高效且正交的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對是密碼子拓展技術(shù)的重點研究內(nèi)容，旨在解決工具翻譯效率低、正交性和兼容性差等核心瓶頸。一方面，已被揭示的氨?；磻?yīng)原理和已知的晶體結(jié)構(gòu)為工具配對的理性改造奠定了理論基礎(chǔ)；另一方面，定向進(jìn)化技術(shù)的快速發(fā)展以及海量基因組數(shù)據(jù)的深度挖掘加速了新型氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對的開發(fā)。下文將重點討論氨酰-tRNA合成酶和tRNA 改造過程中所涉及的方法和相關(guān)的研究進(jìn)展。

在獲得了tRNA 水平正交的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對基礎(chǔ)之上，針對氨酰-tRNA 合成酶的后續(xù)改造主要集中在氨基酸底物識別口袋或編輯結(jié)構(gòu)域的活性位點。傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法通常利用連續(xù)正反向迭代篩選原理，在建立氨基酸識別口袋突變體文庫之后，通過連續(xù)正選擇（抗生素抗性）和反選擇（毒性蛋白產(chǎn)生）來分離可特異性引入非天然氨基酸的氨酰-tRNA 合成酶變體［33］。氨酰-tRNA合成酶的編輯活性位點決定自身的矯正活性，用于水解錯配的氨基酸，對其進(jìn)行改造亦可有效提高非天然氨基酸的引入效率。例如，對EcLeuRS 酶編輯活性位點的失活突變可降低其識別天然底物亮氨酸的能力，從而提高翻譯過程中非天然氨基酸的引入效率［34］。除了傳統(tǒng)方法，新一代蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方法加速了氨酰-tRNA合成酶的開發(fā)。建立包含更多活性位點的突變體文庫或者通過易錯PCR 獲得隨機突變等方法，為獲得更優(yōu)質(zhì)的正交配對提供了可能性［35］。此外，多元自動化基因組工程（multiplex automated genome engineering， MAGE）和噬菌體輔助持續(xù)進(jìn)化（phage-assisted continuous evolution， PACE）技術(shù)也在密碼子擴展工具開發(fā)過程中起到了重要作用［36-37］。MAGE 技術(shù)可在細(xì)胞群內(nèi)創(chuàng)建組合遺傳多樣性的大型突變體文庫［38］。 PACE 技術(shù)的優(yōu)勢則在于不依賴已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過體內(nèi)隨機誘變，實施工具效率和細(xì)胞生長相耦聯(lián)的篩選方法，不僅可以在短時間內(nèi)獲得目標(biāo)突變體，還有助于揭示工具酶關(guān)鍵殘基的未知功能［28，39］。

理性設(shè)計和定向進(jìn)化策略亦可有效地用于tRNA 的改造和優(yōu)化。例如，tRNA 的受體莖是被延伸因子（elongation factor， EF-Tu）識別的特征元素，將大腸桿菌tRNASec的受體莖移植到tRNASer上，建立雜交tRNAUTu成功解決了EF-Tu 無法識別tRNASec的問題［40］。通過后續(xù)的定點誘變，獲得了比野生型活性更高的突變體tRNAUTuX，從而推動了硒蛋白的高效合成［41］。此外，通過對構(gòu)建MjtRNATyr的突變體庫和正反向篩選，獲得了更容易被延伸因子EF-Tu 識別的突變體tRNA，有助于提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量［42］?；赑ylRS 酶不識別tRNAPyl的反義密碼子環(huán)特性，tRNAPyl反義密碼子環(huán)可被任意改造，用于讀取不同的密碼子［43］。通過對tRNAPyl反義密碼莖的定向進(jìn)化，可進(jìn)一步篩選出翻譯效率更高的tRNAPyl突變體（tRNAPly-Opt）［44］。未來，隨著生化原理解析的深入和相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，tRNA 這一核心翻譯元件的開發(fā)優(yōu)化有望進(jìn)一步突破，實現(xiàn)從源頭上推動密碼子拓展技術(shù)的升級和應(yīng)用。

1.3 其他關(guān)鍵翻譯元件的改造

除了氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 配對之外，核糖體、延伸因子、釋放因子等翻譯元件也在翻譯過程中扮演著非常重要的功能，影響翻譯效率及編碼氨基酸的特異性。其中，核糖體是蛋白質(zhì)合成的分子機器；延伸因子識別氨酰-tRNA，并攜帶其進(jìn)入核糖體的A 位點；多肽鏈合成完成后通過釋放因子（release factor，RF）識別終止密碼子實現(xiàn)完整肽鏈和核糖體從mRNA 上的釋放［45］。有研究通過對大腸桿菌核糖體中16S rRNA 的改造來構(gòu)建正交的核糖體系統(tǒng)［46］。也有研究通過對16S rRNA 和23S rRNA 之間加以物理束縛以避免工程亞基與天然亞基發(fā)生交叉裝配，保障了工程核糖體和天然核糖體之間的平行功能［47-48］。此外，研究發(fā)現(xiàn)工程化的核糖體也可以起到阻礙釋放因子的作用，促進(jìn)非天然氨基酸的引入［45］。部分非天然氨基酸由于其龐大側(cè)鏈結(jié)構(gòu)或攜帶某種電荷，其氨酰-tRNA無法被延伸因子識別或者受到核糖體阻礙導(dǎo)致該非天然氨基酸的編碼效率低下。有相關(guān)研究則通過改造延伸因子實現(xiàn)了在大腸桿菌中基因編碼帶負(fù)電荷的磷酸化絲氨酸［49］。另外，當(dāng)終止密碼子被選擇用于編碼非天然氨基酸，釋放因子的識別也會引起翻譯終止的競爭，從而降低目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量［圖1（a）］。研究人員則通過敲除UAG 重編大腸桿菌中的RF1 來提高非天然氨基酸的引入效率［50］。相比原核生物，真核釋放因子eRF1 可識別三種終止密碼子，研究人員則采取了eRF1 改造而非刪除的策略，在哺乳動物細(xì)胞中開發(fā)出針對UAG 識別特異性減弱的eRF1 突變體，并證實了該策略的可行性［51］。

綜上所述，構(gòu)建正交的翻譯體系，需要綜合考慮氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運、多肽鏈合成的起始、延長、終止和釋放等多個過程，從而能精確地操縱和調(diào)控參與上述過程的各種翻譯元件。未來的研究需要考慮不同翻譯元件之間的相互影響，系統(tǒng)地對多個元件進(jìn)行迭代升級，并使其協(xié)同合作，才有望進(jìn)一步發(fā)展更高效的新一代遺傳密碼子拓展技術(shù)所需的翻譯系統(tǒng)。

2 密碼子拓展系統(tǒng)的適配底盤

用于密碼子拓展應(yīng)用的翻譯工具需要配套以相應(yīng)的底盤細(xì)胞來承載其功能的實現(xiàn)。原理上，在未改造的底盤細(xì)胞中過量表達(dá)密碼子拓展翻譯工具會導(dǎo)致翻譯錯誤率的提高，從而造成細(xì)胞毒性，并產(chǎn)生細(xì)胞資源的浪費，不利于后續(xù)應(yīng)用［52］。以琥珀終止密碼子介導(dǎo)的密碼子拓展系統(tǒng)為例，該過程一方面受到翻譯終止的競爭，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白得率較低；另一方面造成其他蛋白翻譯終止延伸，引起細(xì)胞毒性。開發(fā)高適配性底盤細(xì)胞，避免密碼子拓展翻譯工具引起的細(xì)胞功能紊亂，是建立基于細(xì)胞體系的高效密碼子拓展系統(tǒng)中必不可少的關(guān)鍵一環(huán)。此外，也可以通過利用無細(xì)胞體系的方式避免脅迫問題?；跓o細(xì)胞體系的密碼子拓展系統(tǒng)由于擺脫了對適配底盤的依賴，可避免細(xì)胞生理脅迫或細(xì)胞膜屏障等限制，在如合成毒性蛋白和提高非天然氨基酸利用率方面有其獨特優(yōu)勢［53-54］。本節(jié)將主要圍繞基于細(xì)胞體系的適配性改造方式展開介紹。

目前，針對體內(nèi)密碼子拓展系統(tǒng)的適配底盤構(gòu)建主要通過兩種思路實現(xiàn)：一是通過對底盤細(xì)胞的基因組進(jìn)行目標(biāo)密碼子的全基因組精簡，以釋放出空白密碼子來編碼新的氨基酸，從而實現(xiàn)密碼子拓展；二是通過加入非天然堿基對，使得基因組對應(yīng)的密碼子組合數(shù)增加，利用新密碼子來編碼非天然氨基酸，從而實現(xiàn)對密碼子內(nèi)涵的拓展。此外，亦有研究人員通過改造tRNA 和核糖體來實現(xiàn)四聯(lián)密碼子介導(dǎo)基因編碼非天然氨基酸過程，達(dá)到密碼子拓展的目的［55］。然而，由于引入的四聯(lián)密碼子會存在于其他mRNA 中，從而導(dǎo)致目標(biāo)氨基酸被非特異性引入其他蛋白質(zhì)中，并引起該密碼子后序列的移碼錯譯。為了解決該問題，四聯(lián)密碼子引入的同時也需要將基因組上其他可形成該密碼子組合的序列進(jìn)行整體替換，本質(zhì)上屬于上文提出的第一種思路。另一種解決方案可通過設(shè)計和構(gòu)建正交的核糖體，保證該核糖體只特異性地識別含有四聯(lián)密碼子的mRNA［55-57］。此外，最近研究人員也成功利用相分離的策略在空間上對非天然氨基酸引入系統(tǒng)與細(xì)胞內(nèi)源翻譯系統(tǒng)進(jìn)行分離，實現(xiàn)在目標(biāo)mRNA 中的指定位點引入非天然氨基酸，能有效地降低非天然氨基酸引入所帶來的細(xì)胞功能紊亂程度［58］。本節(jié)將重點討論基于全基因組精簡和引入非天然核酸這兩種策略的適配底盤構(gòu)建的研究進(jìn)展。

2.1 全基因組密碼子精簡的適配底盤構(gòu)建

使用全基因組密碼子精簡思路構(gòu)建用于密碼子拓展的適配性底盤需要實現(xiàn)兩點：①從有義密碼子或終止密碼子中選取特定目標(biāo)密碼子，在適配底盤的基因組中進(jìn)行全局替換，將其替換為其他同義密碼子，并引入可特異性識別該密碼子的外源翻譯工具，用于重新編碼的非天然氨基酸；②刪除目標(biāo)密碼子原來對應(yīng)的內(nèi)源tRNA（若是終止密碼子，則是刪除或改造對應(yīng)的釋放因子），防止原有tRNA 或釋放因子與工具tRNA 競爭解碼目標(biāo)基因上的目標(biāo)密碼子。

實現(xiàn)全基因組精簡的手段主要是通過基因組編輯和基因組合成?；蚪M編輯的策略適用于基因組較小的底盤細(xì)胞，但針對基因組較大的底盤細(xì)胞，工作量及技術(shù)難度則使得該策略不再適用。而隨著DNA 合成技術(shù)與基因組構(gòu)建技術(shù)的快速發(fā)展，采用從頭合成構(gòu)建基因組的策略則更為合適?；蚪M合成技術(shù)通過在計算機設(shè)計時引入密碼子精簡設(shè)計，通過合成組裝設(shè)計的基因組實現(xiàn)目標(biāo)密碼子的系統(tǒng)性刪除。

目前大部分密碼子拓展翻譯工具使用UAG 琥珀終止密碼子作為目標(biāo)，因此，適配底盤的研究主要圍繞UAG 密碼子及其對應(yīng)的釋放因子。這種適配底盤的構(gòu)建，主要解決兩方面的問題：一是釋放因子RF1 與翻譯工具競爭識別UAG，使得目標(biāo)蛋白翻譯提前終止，降低蛋白得率；二是翻譯工具識別其他基因的琥珀密碼子，使得其他蛋白質(zhì)翻譯錯誤延長。針對問題一，可以通過刪除釋放因子1 的基因prfA來解決。prfA基因之前被認(rèn)為是必需的基因，無法直接被刪除。后續(xù)有研究表明，刪除prfA基因只需將大腸桿菌中7個必需基因中的UAG 進(jìn)行重編［50］，或需修復(fù)大腸桿菌的釋放因子RF2 基因prfB中的突變［59］。針對問題二，目前大部分非天然氨基酸翻譯工具的效率相對較低，過表達(dá)外源的翻譯工具未見引起嚴(yán)重的細(xì)胞脅迫表型。此外，也有研究表明大腸桿菌細(xì)胞能在一定程度上耐受翻譯錯誤導(dǎo)致的影響［60］。在目前已有的研究基礎(chǔ)上來看，針對基因組進(jìn)行全局系統(tǒng)性精簡似乎并非必需，或者只需精簡必需基因中的UAG［50］。然而，翻譯工具的效率隨著研究持續(xù)開展逐步在提高，配合底盤細(xì)胞面向?qū)嶋H應(yīng)用時，必然要解決細(xì)胞內(nèi)資源利用最優(yōu)化的問題。因此，UAG 的系統(tǒng)性精簡對構(gòu)建高效正交的適配底盤在實際應(yīng)用場景中則尤其必要［圖2（a）］。原核與真核系統(tǒng)在系統(tǒng)性精簡目標(biāo)密碼子方面均有一定的進(jìn)展，如Lajoie等利用基因組編輯技術(shù)MAGE和接合組裝基因組改造技術(shù)（conjugative assembly genome engineering，CAGE）將大腸桿菌基因組中所有終止密碼子UAG 替換為UAA，并刪除了RF1［61］，使UAG 密碼子能夠特異性地僅用于編碼非天然氨基酸［61］。在真核系統(tǒng)中，合成基因組里程碑項目人工酵母基因組合成Sc2.0 中則設(shè)計將全基因組中所有UAG 密碼子精簡為UAA［62］，最終構(gòu)建的合成型酵母則可通過UAG 實現(xiàn)密碼子功能拓展。

圖2 密碼子拓展系統(tǒng)的適配底盤示意圖Fig.2 The chassis for genetic code expansion

雖然，UAG 精簡的底盤能適配于目前大部分的翻譯工具，但若需要同時編碼多個非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，則需要在一個底盤細(xì)胞中具有多個空白密碼子，實現(xiàn)的方式可通過對編碼同一個或多個氨基酸的同義密碼子進(jìn)行系統(tǒng)性的精簡［圖2（a）］。同義密碼子的選擇有幾點因素需要考慮：首先，原有氨酰tRNA 合酶不能以目標(biāo)反密碼子為識別因子，以保證其翻譯工具tRNA的正交性；其次，在選擇目標(biāo)密碼子時也需要考慮有義密碼子的擺動性對翻譯工具tRNA 識別準(zhǔn)確性的影響；最后，同義密碼子的精簡過程中，還需要綜合考慮同義密碼子在基因組的特定位置可能存在的特定功能［63-64］，如對基因內(nèi)/基因間相互作用［65］、作為轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件［66-67］、影響核糖體結(jié)合能力［68］、調(diào)節(jié)mRNA水平與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［69-75］、控制翻譯速度［76-77］，影響蛋白質(zhì)折疊與分泌［68，78-82］等與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的功能。其中，與第三點相關(guān)的研究目前還存在較大的空白，因此實現(xiàn)上仍缺乏足夠的理論基礎(chǔ)支持。有研究證明，即便是UAG 密碼子全基因組去除菌株，在某些條件下仍有生長缺陷，而通過適應(yīng)性進(jìn)化的方式研究發(fā)現(xiàn)，生長缺陷可能與翻譯因素相關(guān)，間接說明了密碼子可能同時帶有其他調(diào)控功能以影響翻譯過程［83］。目前，針對原核系統(tǒng)大腸桿菌中對同義密碼子精簡的影響因素已有了一定的探索［72，84-85］，研究表明某些位點的同義密碼子的精簡會對細(xì)胞的活性產(chǎn)生嚴(yán)重的影響?；谶@些發(fā)現(xiàn)，兩組研究人員進(jìn)一步分別通過基因組合成技術(shù)構(gòu)建只含有57 個密碼子（進(jìn)行中）［86］和61 個密碼子［87］的大腸桿菌。其中后者獲得的菌株syn61 在倍增時間上比野生菌株慢1.6 倍，可以作為一種潛在的多密碼子拓展適配底盤。此外，在近期完成的新月柄桿菌基因組合成中［88］，也將UUA 和UUG 密碼子在基因組中進(jìn)行系統(tǒng)性精簡作為設(shè)計原則之一，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)對菌株活性有顯著影響，亦有潛力作為一種新的適配底盤菌。

隨著基因編輯技術(shù)和合成基因組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過全基因組密碼子精簡實現(xiàn)密碼子拓展適配底盤的構(gòu)建取得了不錯的進(jìn)展，并隨之建立了具備一定通用性的系列技術(shù)流程。但是，值得指出的是，由于目前基因組編輯和基因組合成技術(shù)仍存在一定的局限性，且針對同義密碼子的研究基礎(chǔ)尚不夠深入完善，當(dāng)目標(biāo)底盤基因組較大較復(fù)雜時，相應(yīng)的理性設(shè)計可能會存在諸多不可預(yù)測的缺陷，故使用全基因組密碼子精簡的投入之大使得該策略仍難以被廣泛接受。因此，針對這一策略的上游基礎(chǔ)性研究還需要進(jìn)一步投入與積累，以期能為下游的系統(tǒng)性設(shè)計改造與應(yīng)用提供更多技術(shù)與規(guī)律的支撐。

2.2 可識別非天然堿基對的適配底盤改造構(gòu)建

自然生物中存在的三聯(lián)密碼子實際上是4種堿基（胸腺嘧啶與尿嘧啶并不同時存在于同一類核酸分子中）排列組合的呈現(xiàn)（即43= 64 個密碼子）。由此可知，理論上，若使堿基對的數(shù)量增加1 對，則會使得潛在的密碼子數(shù)量理論上可增加至152 個（含有非天然核酸的密碼子可能具有位置效應(yīng)，則可用的“空白密碼子”將少于理論數(shù)量）。目前，研究團隊已開發(fā)出多對能被生物體利用的非天然堿基對［89-90］，并證明非天然堿基對可用于構(gòu)建密碼子拓展系統(tǒng)來對非天然氨基酸進(jìn)行基因編碼［91-93］，第一次以非天然的形式重現(xiàn)了中心法則，為密碼子拓展研究和應(yīng)用提供了一種非常有潛力的新選擇［圖2（b）］。

基于現(xiàn)有非天然堿基對的密碼子拓展適配底盤菌實際上是一種半合成生物（semisynthetic organism，SSO）［94］，構(gòu)建這種生物除了考慮非天然堿基對本身的性質(zhì)外，還需要對底盤菌進(jìn)行針對涉及非天然堿基/核苷酸的轉(zhuǎn)運合成、DNA 復(fù)制酶、RNA 聚合酶、核糖體和與DNA 修復(fù)（特別是堿基錯配修復(fù)） 相關(guān)功能蛋白的改造［95］。Romesberg 課題組在以大腸桿菌為基礎(chǔ)構(gòu)建半合成生物時，利用Phaeodactylum tricornutum三角褐指藻的三磷酸核苷轉(zhuǎn)運蛋白將含有相應(yīng)非天然堿基的三磷酸核苷轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)［94］。研究組通過對引入的非天然堿基對進(jìn)行優(yōu)化，能夠達(dá)到在一定程度上不被堿基錯配修復(fù)機制識別，同時能使用胞內(nèi)的DNA 復(fù)制酶、T7 RNA 聚合酶以及核糖體，以質(zhì)粒的形式完成DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯［91，94］，最終實現(xiàn)非天然氨基酸的編碼。

采用非天然堿基對的優(yōu)勢在于可避免對基因組進(jìn)行大規(guī)模的改造，并能實現(xiàn)多密碼子拓展，靈活性更強。然而，該策略目前只在原核生物中以質(zhì)粒DNA的形式實現(xiàn)［94］，且其在體內(nèi)DNA中長時間穩(wěn)定存在，仍需要依賴一套維持機制（使用CRISPR/Cas系統(tǒng)去除突變的非天然堿基對）［94］，整合至基因組后是否能在體內(nèi)穩(wěn)定維持非天然堿基對并穩(wěn)定行使功能仍未見報道。而該策略若應(yīng)用于真核系統(tǒng)，目前亦只能通過瞬時轉(zhuǎn)化的方法實現(xiàn)非天然氨基酸的編碼［93］。該策略最終仍依賴于設(shè)計開發(fā)一套正交的適應(yīng)于非天然堿基對的DNA 復(fù)制酶、RNA 聚合酶、核糖體及非天然堿基對/核苷酸的合成或轉(zhuǎn)運機器，以保證底盤的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯活動高效進(jìn)行。因此，基于非天然核酸的密碼子拓展系統(tǒng)仍需要后續(xù)系統(tǒng)的優(yōu)化和完善。

3 基因密碼子拓展技術(shù)的應(yīng)用

隨著高效正交的翻譯工具及適配性底盤被不斷地開發(fā)出來，基因密碼子拓展技術(shù)得到了逐步發(fā)展和完善，可將種類繁多的非天然氨基酸引入到目標(biāo)蛋白中的指定位點。這些非天然氨基酸可擁有各種類型的特殊基團（例如人工設(shè)計的新型氨基酸側(cè)鏈基團），從而賦予目標(biāo)蛋白新的物理化學(xué)性質(zhì)，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的拓展，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能。本節(jié)將重點介紹和討論基因密碼子拓展技術(shù)在一些重點的應(yīng)用領(lǐng)域取得的現(xiàn)階段進(jìn)展，如蛋白質(zhì)功能控制、翻譯后修飾等蛋白質(zhì)調(diào)控的上游使能技術(shù)，以及如熒光顯影探針、新型治療和生物防控等可直接用于科研和生產(chǎn)的新型生物技術(shù)。

3.1 蛋白質(zhì)功能控制

精準(zhǔn)操縱蛋白質(zhì)功能為細(xì)胞生命活動的調(diào)控開辟了新的路徑，人工控制蛋白質(zhì)功能的方法包括表達(dá)控制與活性控制。傳統(tǒng)的方法通常是利用操縱子等啟動元件來實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上對蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控［96］，而密碼子拓展技術(shù)可用于開發(fā)出在翻譯水平上精確控制蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。通過在目標(biāo)蛋白的基因內(nèi)部引入終止密碼子，借助基因密碼子拓展工具，即可通過非天然氨基酸的添加或刪減來控制全長蛋白的表達(dá)與否。例如，通過引入正交的非天然氨基酸編碼工具，可實現(xiàn)對基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas9 中關(guān)鍵酶Cas9 的表達(dá)調(diào)控，使得有功能的全長Cas9 的表達(dá)受外源添加的非天然氨基酸底物控制，從而實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)對于基因編輯過程的開關(guān)調(diào)控［97］。

此外，利用基因密碼子拓展技術(shù)亦可以開發(fā)出具有時間和空間分辨率的蛋白質(zhì)功能調(diào)控方法。通過把酶活性位點的關(guān)鍵氨基酸替換成攜帶光保護(hù)基團的衍生氨基酸，可實現(xiàn)酶的“光開關(guān)”調(diào)控。具體而言，氨基酸側(cè)鏈上的保護(hù)基團起到封閉作用，經(jīng)過固定波長的光線照射后，非天然氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團被移除，功能基團得到釋放，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)活性。利用半胱氨酸和賴氨酸作為目標(biāo)位點，研究證明“光開關(guān)”調(diào)控策略可以用于調(diào)控細(xì)胞中煙草蝕刻病毒蛋白酶和Cas9 的活性［98］。該調(diào)控策略同樣適用于DNA 重組酶活性的精確調(diào)控，并被后續(xù)應(yīng)用于斑馬魚胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞譜系的追蹤研究［99-100］。上述方法需要選擇目標(biāo)蛋白中的特定活性殘基，對各種類型的蛋白質(zhì)均需要進(jìn)行定制化的策略設(shè)計，具有一定的局限性。最近，研究人員發(fā)展了更具普適性的蛋白質(zhì)功能調(diào)控技術(shù)。具體而言，該新型技術(shù)基于可遺傳編碼非天然氨基酸的“鄰近脫籠”策略，結(jié)合計算機輔助設(shè)計與篩選，可在活體細(xì)胞或動物內(nèi)瞬時激活各類型蛋白質(zhì)，為許多重要細(xì)胞生理過程的研究提供了新的化學(xué)生物學(xué)工具［101］。

3.2 翻譯后修飾

翻譯后修飾參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)眾多關(guān)鍵的生命活動調(diào)控過程，這些修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能更為豐富，調(diào)節(jié)更精細(xì)，作用更專一。因此，基于翻譯后修飾的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究是該領(lǐng)域的一個重點方向。得益于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，許多翻譯后修飾的種類和位點被不斷發(fā)掘，但是，在體內(nèi)和體外精確地合成帶有修飾的功能蛋白仍然挑戰(zhàn)巨大，嚴(yán)重制約了對其進(jìn)行分子和生化原理的深度研究。以體內(nèi)合成磷酸化蛋白為例，傳統(tǒng)的方法是將絲氨酸/蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼醽砟M其磷酸化的作用，但具有作用效果不真實的劣勢。此外，磷酸化是一個體內(nèi)高度動態(tài)變化的瞬時過程，單個蛋白中存在眾多潛在的修飾位點，且作用相關(guān)的激酶和磷酸酶常常未知，也加大了體內(nèi)和體外合成磷酸化蛋白的難度［102］。利用基因密碼子拓展技術(shù)可實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白中指定位點進(jìn)行真實的翻譯后修飾，已經(jīng)成功實現(xiàn)絲氨酸、色氨酸及絡(luò)氨酸的磷酸化修飾。通過利用古菌中磷酸化絲氨酸合成酶SepRS 和改造的tRNASep，并對延伸因子EF-Tu進(jìn)行定向進(jìn)化，科學(xué)家在大腸桿菌中實現(xiàn)了由終止密碼子UAG 介導(dǎo)的磷酸化絲氨酸合成［103］。后續(xù)實驗表明，通過對上述翻譯元件的進(jìn)一步改造和定向進(jìn)化，以及利用UAG 密碼子被系統(tǒng)重編的底盤細(xì)胞，密碼子拓展技術(shù)可以更為高效地基因編碼攜帶磷酸化絲氨酸的蛋白質(zhì)［104-105］。此外，磷酸化的絲氨酸可以轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸，因其具有不飽和鍵，可與帶有各種翻譯后修飾的側(cè)鏈基團連接，用于體外合成具有真實修飾的蛋白質(zhì)，應(yīng)用前景廣闊［106］。通過構(gòu)建磷酸化蘇氨酸生物合成通路，并對SepRS/tRNASep工具配對開展連續(xù)的定向進(jìn)化，輔助以深度測序分析介導(dǎo)的并行正向篩選策略，高效基因編碼磷酸化蘇氨酸的方法亦被開發(fā)出來［107］。此外，利用基于非天然氨基酸的脫保護(hù)和前肽策略，不同的團隊成功地開發(fā)了提高大腸桿菌體內(nèi)磷酸化酪氨酸和類似物的濃度的方法，并實現(xiàn)了合成指定位點上攜帶磷酸化酪氨酸及其類似物的蛋白質(zhì)［108］。除了用于合成磷酸化蛋白，基因密碼子拓展技術(shù)亦可合成乙酰化、泛素化和甲基化修飾的賴氨酸［7］。上述翻譯后修飾的氨基酸既可以被直接引入到蛋白質(zhì)中的指定位點，也可以通過后續(xù)的選擇性化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)［109］。綜上，基因密碼子拓展技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于各類型的翻譯后修飾研究，為進(jìn)一步理解其作用機制和生理功能的科研或者臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 熒光顯影探針

熒光顯影在蛋白質(zhì)追蹤和定位研究中有著非常廣泛的應(yīng)用，通過熒光顯影可以在細(xì)胞甚至細(xì)胞器層面上對目標(biāo)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的定位。常規(guī)的熒光顯影方法主要使用熒光蛋白與小分子化合物探針。雖然借助各種類型的熒光蛋白可有效地用于熒光成像和追蹤［110-111］，但與熒光蛋白的融合可能會改變目標(biāo)蛋白的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)，影響后續(xù)的結(jié)果分析。雖然小分子化合物探針靈敏且穩(wěn)定性高，但是通常無法特異性地結(jié)合在目標(biāo)蛋白上。通過基因密碼子拓展技術(shù)可以實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的顯影示蹤。具體而言，在不影響目標(biāo)蛋白功能的情況下，可將攜帶高化學(xué)反應(yīng)性基團的非天然氨基酸引入到目標(biāo)蛋白的指定位點，通過特定的化學(xué)反應(yīng)（如點擊化學(xué)）可實現(xiàn)蛋白質(zhì)與熒光探針的生物正交結(jié)合，用于后續(xù)熒光成像。例如，含降冰片烯的賴氨酸衍生物可以與四嗪類熒光探針快速結(jié)合［112］，反式環(huán)辛烯賴氨酸則可以與類羅丹明的熒光探針產(chǎn)生正交反應(yīng)［113］，用于蛋白質(zhì)顯影追蹤。密碼子拓展技術(shù)在蛋白質(zhì)顯影追蹤方面有兩點顯著的優(yōu)勢：經(jīng)過設(shè)計與篩選后的非天然氨基酸側(cè)鏈基團與熒光探針具有高選擇性，保證兩者可以進(jìn)行高效準(zhǔn)確的生物正交反應(yīng)；密碼子拓展技術(shù)可以將非天然氨基酸引入到目標(biāo)蛋白的非關(guān)鍵位點，從而盡量避免對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生潛在影響。

3.4 新型治療策略

通過基因密碼子拓展技術(shù)向細(xì)胞因子、抗體、受體蛋白等免疫相關(guān)蛋白中引入各類型的非天然氨基酸為新型治療策略開辟了新的領(lǐng)域?？贵w作為一種具有高特異性識別能力的蛋白質(zhì)，可以將藥物分子靶向性地帶到靶向作用細(xì)胞，以減少對正常細(xì)胞的傷害。早期抗體耦聯(lián)藥物通過化學(xué)修飾后與抗體的賴氨酸或半胱氨酸進(jìn)行反應(yīng)耦聯(lián)，實現(xiàn)藥物分子的靶向傳輸［114-115］。但非特異性耦聯(lián)方式會導(dǎo)致抗體上攜帶的藥物分子數(shù)量不均勻，進(jìn)而影響藥效和導(dǎo)致細(xì)胞毒性。在新一代抗體耦聯(lián)藥物研發(fā)過程中，非天然氨基酸（例如對乙酰苯丙氨酸和疊氮苯丙氨酸）可作為正交的耦聯(lián)反應(yīng)位點，與藥物發(fā)生特異性的結(jié)合，從而精確控制藥物抗體比例。使用肟連接與無銅點擊化學(xué)可以將藥物準(zhǔn)確地耦聯(lián)在抗體中非天然氨基酸的指定位點［116-117］。此外，一些條件更為溫和的耦聯(lián)反應(yīng)被相繼開發(fā)出來。例如，增加皮克特-斯賓格勒（Pictet-Spengler，P-S）反應(yīng)使肟連接反應(yīng)可以在中性pH 條件下完成，或是使用呋喃基的非天然氨基酸進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)小分子化合物的耦聯(lián)［118-119］。嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor-T，CAR-T）免疫療法是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法，避免細(xì)胞因子釋放綜合征是目前開發(fā)高安全性CAR-T 免疫療法的研究重點［120］。基因密碼子拓展技術(shù)可用于控制工程化T細(xì)胞的特異性和活性，通過利用開關(guān)分子來連接T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，為開發(fā)新一代CAR-T 免疫療法奠定基礎(chǔ)［121］。此外，基因密碼子拓展技術(shù)還可以用于新一代疫苗的研發(fā)。傳統(tǒng)的疫苗制作需要對活病毒進(jìn)行減活或者滅活處理，病毒蛋白結(jié)構(gòu)在滅活過程中一旦被破壞，則可能難以達(dá)到理想的接種效果［122］。科學(xué)家把病毒基因中不易返祖的位點突變成UAG 終止密碼子，利用密碼子拓展技術(shù)實現(xiàn)病毒在特殊細(xì)胞系的增殖，從而制備與正常病毒相似免疫原性的非天然病毒［123］。這些病毒不能在正常細(xì)胞中擴增，可顯著提升疫苗的安全性，具有巨大的應(yīng)用潛力。

3.5 生物防控

近些年來，合成生物學(xué)突取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，基因改造生物在生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越舉足輕重的作用，科學(xué)家與大眾對生物安全的關(guān)注也被提升至新的高度?；诜翘烊话被岬牡鞍踪|(zhì)表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)從頭設(shè)計策略為生物防逃逸技術(shù)打開了一個嶄新的研發(fā)視角。生物防控手段可依賴于遺傳隔離、營養(yǎng)缺陷型調(diào)控、基因回路設(shè)計等思路［124-126］，但上述方法的有效性易被自然突變、環(huán)境補充和水平基因轉(zhuǎn)移等因素打破［127］?；蛎艽a子拓展技術(shù)可用于控制細(xì)胞中必需蛋白的表達(dá)或者功能，進(jìn)而構(gòu)建出依賴于非天然氨基酸的生命體。例如，通過把甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶這一必需蛋白中關(guān)鍵的組氨酸替換成為組氨酸類似物，科學(xué)家成功地構(gòu)建出生長依賴于外源氨基酸的大腸桿菌［128］。上述策略雖然有效，但是只適用于特定類型的蛋白質(zhì)（如前文提到的金屬結(jié)合蛋白）。通過對目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行重新設(shè)計或者定向進(jìn)化，研究人員利用密碼子拓展技術(shù)成功獲得了功能依賴于某種非天然氨基酸的新型蛋白，該策略具有更高的普適性，并可有效地避免基因改造生物逃逸到自然環(huán)境中［129-130］。值得指出的是，上述策略將必需基因中特定氨基酸對應(yīng)的密碼子突變成為終止密碼子，若對應(yīng)的mRNA 發(fā)生回復(fù)突變等情況會使得防逃逸策略的有效性喪失。利用基因組重編的大腸桿菌作為基因密碼子拓展技術(shù)的底盤，研究團隊系統(tǒng)地測試了大腸桿菌眾多必需基因中不同位點引入非天然氨基酸后對于生物防控策略的有效性，并發(fā)現(xiàn)多個位點和基因的組合可有效地降低非天然氨基酸依賴型生長的逃逸概率［131］。此外，通過往細(xì)胞中引入毒素-抗毒素表達(dá)系統(tǒng)，并利用非天然氨基酸的加減作為抗毒素蛋白表達(dá)的開關(guān)，亦可構(gòu)建出有效的生物防控方法［132］。綜上所述，利用基因密碼子拓展技術(shù)，通過巧妙地選擇目標(biāo)蛋白的種類并對其進(jìn)行設(shè)計或改造，基于非天然氨基酸的新型生物防控策略為本領(lǐng)域的發(fā)展帶來了新的動能。

4 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生命活動的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)功能化策略創(chuàng)新被認(rèn)為是推動生命科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化的重要引擎之一。通過基因密碼子拓展技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能創(chuàng)新在過去20 多年中發(fā)展迅速，在翻譯工具改造及底盤細(xì)胞開發(fā)方面均取得了可喜的進(jìn)展。然而，目前已開發(fā)的基因密碼子拓展系統(tǒng)（尤其是基于真核生物的系統(tǒng)）普遍存在翻譯效率低、正交性和兼容性差等核心瓶頸。針對翻譯系統(tǒng)中多種翻譯元件的系統(tǒng)性優(yōu)化改造乃至從頭設(shè)計，構(gòu)建具有多個空白密碼子的底盤細(xì)胞，針對翻譯工具和底盤細(xì)胞的相互適配原則的探索與優(yōu)化改造，以及結(jié)合這些研究內(nèi)容實現(xiàn)同時基因編碼多種非天然氨基酸，將是該領(lǐng)域未來研究的重點和難點。

隨著對于蛋白質(zhì)合成機制理解的不斷深入、合成生物學(xué)技術(shù)及定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用、基因組與宏基因組數(shù)據(jù)的持續(xù)積累及解讀工具的迭代，更多高效、正交的翻譯工具及適配底盤有望被開發(fā)，促進(jìn)基因密碼子拓展技術(shù)的快速發(fā)展。利用基因密碼子拓展技術(shù)實現(xiàn)基因編碼非天然氨基酸，將成為繼無細(xì)胞體系、化學(xué)合成等體外合成方法之后實現(xiàn)蛋白質(zhì)和多肽功能創(chuàng)新的一種新策略，為相關(guān)的下游應(yīng)用的發(fā)展提供了新契機，推動人類在醫(yī)藥健康、能源、材料等關(guān)鍵領(lǐng)域發(fā)展。