響應(yīng)面法優(yōu)化祁門(mén)紅茶多酚浸提工藝的研究

黃良芳 張振陽(yáng) 潘樂(lè)

摘要 祁門(mén)紅茶是中國(guó)歷史名茶，其含有的多酚具有促進(jìn)健康的作用。采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇浸提祁門(mén)紅茶多酚的工藝參數(shù)。主要考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸取溫度和浸取時(shí)間對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響，結(jié)果表明以57.83%乙醇為提取液，在85.07 ℃下浸提65.33 min，在此條件下多酚類(lèi)的提取率最高（130.554 mg/g）。該研究為今后祁門(mén)紅茶中多酚的提取提供了參考。

關(guān)鍵詞 祁門(mén)紅茶;多酚;響應(yīng)面法;優(yōu)化;提取工藝

Abstract Keemun black tea is a famous tea in Chinese history.It contains polyphenols，which can promote human health.In this paper，response surface methodology was used to optimize the process parameters of ethanol extraction of polyphenols from keemun black tea.The effects of ethanol volume fraction，extraction temperature and extraction time on the extraction rate of polyphenols from keemun black tea were mainly investigated.The results showed that the optimized conditions were as follows：using 57.83% ethanol as extract for 65.33 minutes at 85.07 ℃.Under these conditions，the highest extraction rate of polyphenols was 130.554 mg/g.The research results provided references for the subsequent extraction of polyphenols from keemun black tea.

Key words Keemun black tea;Polyphenols;Response surface methodology;Optimization;Extraction process

茶葉中富含茶多酚、生物堿、氨基酸、維生素、多糖類(lèi)、酶類(lèi)、微量元素等多種有利于人體健康的成分[1]。其中，多酚由于能形成各類(lèi)自由基，保護(hù)人體組織免受氧化作用的損害，從而具有提高機(jī)體的免疫功能、抗癌、抗衰老等作用，引起人們的廣泛研究[2]。

祁門(mén)紅茶因其產(chǎn)地優(yōu)越的自然條件和優(yōu)良的茶葉品種而成為極品紅茶，一直以來(lái)享有盛譽(yù)[3-4]。祁門(mén)紅茶是完全發(fā)酵茶，發(fā)酵程度高，其中的多酚類(lèi)成分通過(guò)氧化和聚合作用形成一系列新的具有生物活性的化合物，如茶黃素、茶紅素、茶褐素等[5-6]。因此，祁門(mén)紅茶中多酚的含量低于綠茶，但其相對(duì)生物活性沒(méi)有降低，仍具有良好的抗氧化活性，甚至還具有一些綠茶所不具有的藥理作用，其特有的生物學(xué)功能越來(lái)越受到人們的關(guān)注[7-9]。

浸提法是目前從茶葉中獲取多酚最常用的方法，浸提工藝的研究對(duì)于工業(yè)化制備多酚具有重要意義[10]。目前紅茶多酚浸提工藝的研究方法主要是單因素篩選和正交試驗(yàn)法，方法簡(jiǎn)單易行但數(shù)據(jù)不夠全面[11-12]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種結(jié)合數(shù)學(xué)建模和綜合試驗(yàn)來(lái)科學(xué)設(shè)計(jì)優(yōu)化測(cè)試的方法，由Box等[13]提出，具有精度高、預(yù)測(cè)性能好以及能夠研究各種因素之間相互作用等優(yōu)點(diǎn)[14]。筆者利用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化祁紅中多酚的浸取工藝[15-19]，旨在為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用祁門(mén)紅茶多酚資源提供更多參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料。祁門(mén)紅茶購(gòu)于安徽省黃山市祁門(mén)縣歷口茶廠，粉碎后過(guò)200目篩。

1.1.2 試劑與儀器。沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）和FolinCiocalteu試劑均購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司;其余試劑（AR）均購(gòu)于aladdin試劑網(wǎng);試驗(yàn)用水為超純水。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2600），蘇州島津;數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6），金壇榮華;中藥粉碎機(jī)（XFB-1000），吉首中誠(chéng);電子分析天平（FA2104B），上海越平。

1.2 試驗(yàn)方法[20-23]

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，。

量取Folin-Ciocalteu試劑20 mL，加水定容于200 mL容量瓶中，制得100 mL/L FolinCiocalteu試劑。用水溶解37.50 g Na2CO3，定容于500 mL容量瓶中，制得75 g/L Na2CO3溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.028 3 g 沒(méi)食子酸，用無(wú)水乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中。移取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL上述溶液，各加水定容于100 mL容量瓶中，即得沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別移取1.0 mL 5種濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入5.0 mL 配制的Folin-Ciocalteu試劑，5 min后再各加入4.0 mL Na2CO3溶液，室溫下顯色反應(yīng)1 h后，測(cè)定波長(zhǎng)765 nm時(shí)的吸光度（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 多酚含量及提取率的計(jì)算。

分別移取祁門(mén)紅茶浸提液，按照“1.2.1”所述方法進(jìn)行顯色，根據(jù)測(cè)得的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度，并利用公式計(jì)算多酚提取率（單位為mg/g）。

式中，C為茶多酚濃度（單位mg/mL）;V為浸提液體積（單位mL）;N為稀釋倍數(shù);W為紅茶質(zhì)量（單位g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響。取5支比色管，分別放入1.0 g祁門(mén)紅茶茶粉，依次加入50 mL體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，60 ℃ 浸提1 h，靜置后分別移取1 mL上清液，按照“1.2.1”的方法顯色，測(cè)定波長(zhǎng)765 nm 時(shí)的吸光度 （A），并計(jì)算多酚提取率（Y）。

1.2.3.2 浸提溫度對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響。取5支比色管，分別放入1.0 g祁門(mén)紅茶茶粉，依次加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，分別在50、60、70、80 ℃下浸提1 h，靜置后各移取1 mL上清液，按照“1.2.1”的方法顯色，測(cè)定波長(zhǎng)765 nm時(shí)的吸光度 （A），并計(jì)算多酚提取率（Y）。

1.2.3.3 浸提時(shí)間對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響。取5支比色管，分別放入1.0 g祁門(mén)紅茶茶粉，依次加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，80 ℃下分別浸提15、30、45、60、75 min，靜置后各移取1 mL上清液，按照“1.2.1”的方法顯色，測(cè)定波長(zhǎng)765 nm時(shí)的吸光度 （A），計(jì)算多酚提取率（Y）。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、浸提溫度（B）、浸提時(shí)間（C）依照中心組合設(shè)計(jì)規(guī)律，確定每個(gè)影響因素的最佳反應(yīng)區(qū)間（水平），將篩選出的3個(gè)水平編碼規(guī)定為+1、0、-1，分別對(duì)應(yīng)高值、中間值和低值，設(shè)計(jì)因子編碼及水平表（表1）。然后，利用Design-Expert8 軟件的Box-Behnken模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，所得方案如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由圖1可知，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.009 7x+0.028 8（R2=0.999 2），其中x為沒(méi)食子酸濃度（mg/mL），y為765 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響。

多酚分子結(jié)構(gòu)中有大量酚羥基，它們可以與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、纖維素等通過(guò)氫鍵相互結(jié)合，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同。若乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，說(shuō)明與氫鍵的結(jié)合能力弱;若乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，溶劑極性又太小，均不利于多酚的溶出。從圖2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%升至60%，多酚提取率也隨之變大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60% 時(shí)出現(xiàn)最大值，此后多酚提取率明顯下降。因此，對(duì)于浸提祁門(mén)紅茶多酚，最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.2.2 浸提溫度對(duì)祁門(mén)紅茶酚提取率的影響。

溫度能影響分子的熱運(yùn)動(dòng)，升高溫度能提高祁紅多酚分子的滲透、溶解和擴(kuò)散速度，但若溫度過(guò)高，多酚的氧化和分解作用也會(huì)加劇，從而導(dǎo)致提取率的降低。從圖3可以看出，當(dāng)浸提溫度為50～80 ℃時(shí)，隨著浸提溫度的升高，多酚提取率也逐漸變大;當(dāng)浸提溫度超過(guò)80 ℃后多酚提取率逐漸下降。因此，對(duì)于浸提祁門(mén)紅茶多酚，最佳浸提溫度為80 ℃。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響。從圖4可以看出，在15～60 min內(nèi)，祁紅多酚提取率隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而升高;當(dāng)浸提時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多酚提取率逐漸降低，當(dāng)浸提時(shí)間為60 min時(shí)多酚提取率達(dá)到最高值。由此可見(jiàn)，在浸提過(guò)程中，由于溶解作用，多酚逐漸溶出，但隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚也會(huì)逐步氧化和分解，從而使多酚提取率逐漸降低。因此，對(duì)于浸提祁門(mén)紅茶多酚，最佳浸提時(shí)間為60 min。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 運(yùn)用Design-Expert8軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到此次試驗(yàn)的二次多項(xiàng)回歸線性方程：Y=128.55+2.21A+5.91B-1.03C- 0.092AB-2.60AC-0.30BC-3.97A2-5.93B2-4.82C2。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

方差分析表明，相關(guān)系數(shù)R2=0.961 4，校正R2=0.911 8，表明方程的擬合度較好。變異系數(shù)小于10%，表明該試驗(yàn)的可信度和精確度高。響應(yīng)面回歸模型的失擬項(xiàng)顯著，只有3.78%可能來(lái)源于儀器的噪聲，說(shuō)明模型能對(duì)浸提工藝進(jìn)行較好模擬。F值為19.38，P<0.001，表明模型具有很好的顯著性。B、B2、C2的P值均小于0.001，說(shuō)明其對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響極顯著;A、A2的P值均小于0.05，說(shuō)明其對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率有顯著影響，C、AB、AC、BC的P值均大于0.05，表明其對(duì)祁門(mén)紅茶多酚提取率的影響不顯著。

2.4 等高線圖與響應(yīng)面圖分析

圖5a中的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，表明浸提時(shí)間與浸提溫度的交互作用比較顯著，且溫度的影響比時(shí)間更大。從三維響應(yīng)面曲線（圖5b）可以看出，在浸提時(shí)間（60～70 min）、浸提溫度（75～85 ℃）范圍內(nèi)，祁紅多酚提取率在適當(dāng)?shù)臏囟扰c時(shí)間下最大。

從圖6a可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與浸提時(shí)間的交互作用較為顯著。從圖6b可以看出，適當(dāng)延長(zhǎng)浸提時(shí)間有助于增大祁紅多酚的提取率，祁紅多酚提取率有一個(gè)極點(diǎn)，該極點(diǎn)出現(xiàn)的范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%～65%、提取時(shí)間57～69 min。

從圖7a可以看出，浸提溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用不顯著。從圖7b可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%提高到60%，祁門(mén)紅茶多酚提取率升高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高時(shí)，祁門(mén)紅茶多酚提取率逐漸下降。這表明祁門(mén)紅茶多酚提取率存在極大值，且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)二者交互作用不顯著，因此浸提溫度應(yīng)保持在75～85 ℃。

2.5 最佳提取工藝參數(shù)的確定

利用Design-Expert軟件中的Optimization的Numerical功能進(jìn)行優(yōu)化，得到乙醇浸提祁紅多酚最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為57.83%、浸提溫度為85.07 ℃、浸提時(shí)間為65.33 min，此條件下得到的祁門(mén)紅茶多酚提取率為130.554 mg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用修正的最佳提取工藝：用58%乙醇提取液、在85 ℃下浸提65 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明多酚提取率為130.007 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.005 329，與理論值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004 19，說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)值與理論值的擬合性較好。

3 結(jié)論

筆者探討了乙醇浸提黃山祁門(mén)紅茶中多酚的工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定了3個(gè)變量因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度和浸提時(shí)間）的最佳反應(yīng)區(qū)間，然后采用響應(yīng)面法來(lái)設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，用57.83%的乙醇、在85.07 ℃下提取65.33 min，祁門(mén)紅茶多酚提取率最高，為130.554 mg/g。該試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，有效控制了浸提的工藝條件，為今后祁紅多酚的提取工業(yè)化及精深加工提供了理論數(shù)據(jù)支持。

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