鯉魚重組IL–17N 的原核表達條件優(yōu)化及蛋白純化

張磊，唐永凱,2，李紅霞,2，徐逾鑫，李迎賓，俞菊華,2*

(1.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214128；2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫 214128)

白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)家族是一類促炎因子，在宿主防御及各種自身免疫性疾病中有重要作用[1]。哺乳動物IL-17 家族成員包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E 和IL-17F[2]。GUNIMALADEVI 等[3]于2006 年在斑馬魚上克隆到IL-17，開啟了魚類IL-17 基因鑒定及其功能的研究。在魚類中，除IL-17E 外的IL-17家族其他基因已被分離和鑒定。IL-17N 只在硬骨魚類中被發(fā)現[4]。目前，對硬骨魚類IL-17N 的研究主要集中在基因結構、基因克隆等方面，對其功能研究相對較少。

通過原核表達獲得可溶的鯉魚IL-17N 重組蛋白，可為進一步揭示鯉魚IL-17N 的功能提供研究材料。目前，真核基因在原核中的表達多采用大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)。但原核細胞缺少真核蛋白折疊所需的酶，導致外源蛋白在原核表達中常以無生物活性的包涵體形式表達[5-6]。大量研究[7-8]表明，促溶標簽的應用及表達條件的優(yōu)化能提高外源蛋白的可溶性表達。本研究中，通過對鯉魚IL-17N重組蛋白表達條件的優(yōu)化及促溶標簽的選擇，獲得可溶的鯉魚IL-17N 重組蛋白，旨在為鯉魚IL-17N的功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichia coli) DH5α 及Transetta (DE3)購自TransGen Biotech；原核表達質粒pGEX- GST、pCold-SUMO、pMAL-c2X 購自杭州研真生物科技有限公司；限制性核酸內切酶BamH Ⅰ、SalⅠ及DNA Marker 購自TaKaRa；DNA 膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司；蛋白質Marker 購自賽默飛世爾科技。鎳柱購自無錫天演生物技術有限公司。

1.2 原核重組表達質粒的構建

將質粒pGEX-GST 雙酶切獲得的GST 片段插入到質粒pCold-SUMO 的SUMO 融合標簽之后，轉化到E. coilDH5α 感受態(tài)細胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)。利用菌液PCR 和雙酶切鑒定，篩選陽性單克隆菌落，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定，將測序準確的原核重組表達質粒，標記為pCold-SUMO-GST。

以CcIL–17N基因的T-克隆質粒為模板，根據已有鯉魚cDNA 序列，設計引物，即IL-17N-R，5′-ACGCGTCGACCTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GATTCTGTCTGGATGTGG-3′；IL-17N-F，5′-CGG GATCCAGTCCGATCATGGCCCAGTG-3′。在正、反向引物的5′端分別添加BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位點及保護堿基，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以鯉魚IL–17N基因的T-克隆質粒為模板，進行PCR 擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。使用膠回收試劑盒回收PCR 產物，經BamH Ⅰ和SalⅠ酶切后，與被同樣酶切過的pGEX-GST、pCold-SUMO-GST、pMAL-c2X 連接，將連接產物轉化至E. coilDH5α 感受態(tài)細胞中，在氨芐抗性平板上涂布，37 ℃過夜培養(yǎng)。經過菌液PCR 和雙酶切鑒定，篩選陽性單克隆菌落，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定，將測序準確的原核重組表達質粒分別標記為GST-17N、SUMO-GST- 17N、MBP-17N。

1.3 重組蛋白融合標簽的選擇和誘導表達條件的優(yōu)化

將測序準確的重組質粒(GST-17N、SUMO- GST-17N、MBP-17N)分別轉入Transetta(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆于10 mL 含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)過夜。次日，以1∶100 在含氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至吸光度為0.5～0.8 時，分別加入終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L 的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于20、25 ℃誘導2、4、6、8、12 h。離心收集細菌，并超聲裂解細菌后，取總菌和上清進行SDS-PAGE 電泳檢測。以相同培養(yǎng)條件，但沒有添加誘導劑的總菌為對照。

1.4 重組蛋白純化及濃度測定

預試驗發(fā)現SUMO-GST-17N 不能與GST 親和層柱結合，因此，上清裂解液用鎳柱親和層析，使用SCGTMUV-VIS Detector 分離純化，收集200 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫產生峰值時的液體，收集液用SDS-PAGE 電泳檢測。將收集液超濾濃縮于PBS中，考慮到鎳柱純化蛋白存在雜蛋白，參照王欽等[9]的方法，使用已知濃度的牛血清白蛋白(BSA)標準品進行SDS-PAGE 電泳，根據目的帶與BSA 條帶灰度(Tanon GIS imagine)，計算純化后重組蛋白的質量濃度、蛋白質量和摩爾數。

2 結果與分析

2.1 鯉魚IL–17N 重組表達質粒的構建結果

菌液PCR 擴增出的DNA 片段大小符合預期結果(342 bp，圖1)；重組表達質粒(GST-17N、SUMO- GST-17N、MBP-17N)分別雙酶切后，獲得與目的基因(IL–17N)大小一致的DNA 片段(圖2)。

圖1 鯉魚IL–17N 基因的擴增產物 Fig.1 The amplification products of IL-17N of Cyprinus carpio

圖2 鯉魚原核重組表達質粒雙酶切鑒定結果 Fig.2 The result of identification of recombinant prokaryotic expression plasmid

2.2 融合標簽的促溶效果

如圖3 和圖4 所示，重組蛋白GST-17N(相對分子質量為4.25×104)、SUMO-GST-17N(相對分子質量為 5.54×104)、MBP-17N(相對分子質量為6.08×104)的總菌均有表達，且大小與預測一致；重組蛋白MBP-17N、SUMO-GST-17N、GST-17N的可溶表達量依次降低，GST-17N 幾乎都是包涵體表達，SUMO-GST-17N、MBP-17N 上清蛋白占總蛋白比例分別為47.4%、87.0%。綜合考慮單位菌中可溶蛋白獲得量及試驗需求，選擇MBP-17N 重組表達質粒進行進一步研究。

圖3 GST–17N 和SUMO–GST–17N 的表達結果 Fig.3 The result of expression of GST-17N and SUMO-GST-17N

圖4 MBP–17N 的表達結果 Fig.4 The result of expression of MBP-17N

2.3 MBP–17N 蛋白的表達條件和表達量

如圖5 所示，IPTG 終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L 時，MBP-17N 重組蛋白總菌表達量沒有明顯差異，但可溶表達量有明顯差異，0.5 mmol/L 時可溶表達量最高；相同誘導條件下，25 ℃時MBP-17N 的總菌表達量高于20 ℃的。如圖6 所示，總菌表達量隨著時間延長逐漸增加，在8 h 時達到最大后趨于穩(wěn)定?？梢?，IPTG 濃度為0.5 mmol/L，25 ℃誘導8～12 h 時，重組蛋白MBP-17N 可溶表達量最高。

圖5 不同誘導溫度下不同濃度IPTG 誘導MBP-17N 的表達結果 Fig.5 The result of expression of MBP-17N with different concentrations of IPTG and different induction temperatures

圖6 不同誘導時間下MBP-17N 總蛋白的表達結果 Fig.6 SDS-PAGE result of protein expression of MBP–17N with different induction time

2.4 MBP–17N 蛋白的質量濃度

經過鎳柱純化，得到MBP-17N 蛋白單一條帶與預期結果一致，說明經親和層析純化后得到較高純度的融合蛋白；質量濃度為0.88 mg/mL，即1 g總菌獲得0.09 mg 蛋白，融合蛋白摩爾數為1.61 nmol(圖7)。

圖7 MBP–17N 蛋白濃度的測定結果 Fig.7 The result of determination of MBP-17N protein concentration

3 結論與討論

姜媛媛等[10]利用SUMO 融合表達獲得了高純度的、有活性的鼠成纖維細胞生長因子FGF-21、人FGF-21 和人白細胞介素IL-1β。RABHI-ESSAFI等[11]將人干擾素蛋白和GST 融合表達，獲得70%的可溶蛋白。在大腸埃希菌中以包涵體表達的95個哺乳動物蛋白中，MBP 對其中的63 個有促溶效果[12]。本研究中，構建GST-17N、SUMO-GST-17N和 MBP-17N 原核重組表達質粒，結果表明，SUMO-GST、MBP 對目的蛋白均有明顯促溶作用，而GST 幾乎沒有促溶作用。這與RABHI-ESSAFI等[11]的研究結果有明顯差異，說明同一融合標簽對不同蛋白的促溶效果不同。預試驗發(fā)現SUMO- GST-17N 不能與GST 親和層柱結合，推測可能是SUMO-GST 融合標簽組合改變了GST 標簽蛋白的構象，降低了GST 標簽蛋白的結合能力。

誘導劑(IPTG)濃度、誘導時間和溫度均是影響重組蛋白的可溶表達的重要因素[7]。柴政斌等[13]在優(yōu)化融合蛋白GST-PADI4(glutathione-peptidylarginine deiminase )Ⅳ表達條件中發(fā)現，溫度、IPTG 濃度對融合蛋白表達量無明顯影響，但可溶重組蛋白比例在16 ℃時明顯比37 ℃時高，IPTG 使用量在0.1～1.0 mmol/L 范圍內，隨著IPTG 量的減少，可溶目的蛋白的比例隨之增加。在GST-CRH(corticotropinre- leasing hormone，CRH)的表達條件優(yōu)化中發(fā)現，0.1 mmol/L IPTG 誘導的可溶蛋白含量明顯高于其他濃度的[14]。為獲得MBP-17N 的高可溶性表達，本研究對MBP-17N 的表達條件進行了優(yōu)化。結果顯示，隨著IPTG 濃度的變化，MBP-17N 總蛋白表達量沒有明顯差異，但可溶表達量隨IPTG 濃度的升高，在0.5 mmol/L 時達到峰值后逐漸降低，這可能是由于IPTG 有細胞毒性，高濃度的IPTG 可能會導致融合蛋白快速、大量表達而形成包涵體[15]。低溫下大腸埃希菌生長緩慢，一般選擇通過延長誘導表達時間來增加融合蛋白的表達量，但隨著營養(yǎng)物質的消耗，菌體的生長會趨于停滯，融合蛋白的表達不會再明顯增加[13]。本研究中，MBP-17N 的總蛋白表達量隨著誘導時間的延長增加至一定程度后趨于穩(wěn)定。通過對表達條件的摸索，最終確定MBP-17N 的最佳可溶表達條件為0.5 mmol /L IPTG，25 ℃誘導8～12 h。

由于MBP 與直鏈淀粉樹脂結合效率較低，蛋白回收率的效率過低；因此，選用鎳柱對重組MBP-17N 進行純化，結果發(fā)現收集到的蛋白或多或少都存在雜蛋白，推測可能是總蛋白中有類似His 標簽(多個組氨酸并列)結構的非目的蛋白在純化過程中與Ni-NTA 結合[16-18]。鑒于此，BCA 法測定的蛋白濃度要大于實際獲得的目的蛋白濃度，相比之下，使用已知量的標準蛋白(BSA)SDS-PAGE電泳確定目的蛋白會更可靠。