大熊貓源枝孢樣枝孢霉侵染小鼠皮膚的病理學(xué)過程

劉真，劉璐，馬曉平*，姜堯章，王承東，古玉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；3.中國大熊貓保護(hù)研究中心，四川 都江堰 611800；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，四川 雅安 625014)

MA 等[4-5]在大熊貓皮膚病患處和生殖道內(nèi)均發(fā)現(xiàn)枝孢樣枝孢霉，經(jīng)接種感染小鼠致病性試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，枝孢樣枝孢霉對正常家兔和免疫抑制家兔均可致病，對家兔皮膚有較強(qiáng)的致病性，能引起家兔皮膚形成紅斑結(jié)節(jié)，且損傷隨著時間的推移有加重的趨勢，有可能是由紅斑結(jié)節(jié)逐漸發(fā)展為潰瘍并形成肉芽腫等，卻未對該菌的具體侵染過程進(jìn)行深入研究。同年，馬曉平等[6]又研究了各培養(yǎng)環(huán)境因子對枝孢樣枝孢霉生長的影響，得出了枝孢樣枝孢霉的最適生長環(huán)境。桑紅等[2]的研究結(jié)果表明，枝孢樣枝孢霉對小鼠皮膚有較強(qiáng)機(jī)會致病性。GU 等[7]利用差減抑制雜交技術(shù)研究了枝孢樣枝孢霉的分子致病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)枝孢樣枝孢霉α/β 水解酶基因在強(qiáng)弱毒株的表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)，是最有可能的致病基因。迄今尚少見對該菌的具體侵染過程的詳細(xì)報道。筆者研究枝孢樣枝孢霉對動物體的具體侵染過程，旨在對進(jìn)一步診斷、治療、預(yù)防該菌所致暗色絲孢霉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

分離自大熊貓皮膚病患處的枝孢樣枝孢霉[3]，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試動物

180 只健康小鼠6～8 周齡，體質(zhì)量(20±5) g，雌、雄各半。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制

將保存菌株轉(zhuǎn)種于PDA 培養(yǎng)基斜面，25 ℃培養(yǎng)1 周，用0.1 moL/L PBS 液(含0.1%吐溫-80)沖洗斜面，將沖洗液置于離心管中，3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，重復(fù)3 次[8]。最后用0.9%NaCl 溶液稀釋沉淀物，用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，配成1×106cfu/mL 的菌懸液，菌絲與孢子的比例低于1∶10。

INCI中文名稱：抗壞血酸（維生素C），英文名稱：Ascorbic acid，CAS號：50-81-7，英文名：Vitamin C，是一種水溶性維生素，水果和蔬菜中含量豐富。分子式：C6H8O6，分子量：176.13，外觀：無色晶體，熔點(diǎn)：190～192 ℃，沸點(diǎn)：（無），紫外吸收最大值：245 nm，比旋度：+20.5°～+21.5°，呈酸性，具有較強(qiáng)的還原性，加熱或在溶液中易氧化分解，在堿性條件下更易被氧化，為己糖衍生物。

1.2.2 試驗(yàn)動物分組和處理

將供試的180 只小鼠隨機(jī)分為2 組，每組90只。①試驗(yàn)組，腹腔兩側(cè)對稱選2 個點(diǎn)皮下注射，接種0.4 mL 致病菌懸液。②對照組，不接種致病菌，于相同部位注射等量0.9%NaCl 溶液。接種部位均用苦味酸作標(biāo)記。每日固定時間點(diǎn)處死試驗(yàn)組和對照組小鼠各3 只，取接種部位剖檢，并用4%福爾馬林液固定，以備病理學(xué)檢查。

1.2.3 剖解及病理學(xué)觀察

小鼠接種菌后，于12 h(第1 天)觀察體況和接種部位發(fā)病情況，并同時取3 只小鼠以頸椎脫臼法處死剖檢，觀察接種處及周圍皮膚[9]，鉗取接種處皮膚組織塊，用4%福爾馬林液固定，再進(jìn)行脫水透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、HE 染色[10]、PAS銀染、封固等步驟[11]，切片完成后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察及拍照[12]。之后每隔24 h 按上述步驟同樣處理和觀察。根據(jù)病理切片觀察結(jié)果，確定小鼠連續(xù)3 d 感染情況穩(wěn)定的時期，為觀察結(jié)束期。

1.2.4 統(tǒng)計分析

對病理切片拍照后，隨機(jī)選取每天處死小鼠皮膚組織病理切片的30 個同等面積不同視野的圓形區(qū)域，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 統(tǒng)計每個區(qū)域內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)、孢子數(shù)和菌絲數(shù)，并對30 個區(qū)域的總數(shù)取平均數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.5 組織逆培養(yǎng)并鑒定

在超凈工作臺內(nèi)，將剖檢后所取組織樣品浸在75%乙醇中表面除菌，然后用滅菌蒸餾水清洗2 次，用無菌組織剪剪碎組織，然后分點(diǎn)接種到PDA 培養(yǎng)基上。每個樣本接種3 個培養(yǎng)皿，25 ℃培養(yǎng)1～2 周，挑取長出菌落接種于新的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察及顯微鏡下拍攝的菌絲形態(tài)鑒定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體況觀察及剖檢結(jié)果

向小鼠注射菌懸液后，接種部位接種后前8 天并無明顯異常表現(xiàn)(圖1-a)；接種后第9～10 天開始發(fā)病，接種部位出現(xiàn)小面積紅斑，皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀損傷，但并未影響到主要器官，各器官之間未粘連，小鼠也并未有明顯瘙癢等癥狀(圖1-b)；第11～25天發(fā)病明顯，接種部位紅斑面積增大，并且結(jié)節(jié)狀皮膚損傷深，接種處顏色變深，疑似潰瘍性皮損，觸感有增生物，小鼠開始有瘙癢感，飲食明顯減少等癥狀明顯(圖1-c)；第26～30 天接種部位皮膚損傷更深入，有竇道形成，甚至出現(xiàn)局部壞死，增生物觸感更加明顯，出現(xiàn)黏膜粘連(圖1-d)。對照組同樣部位注射等量生理鹽水后未出現(xiàn)肉眼可見病理變化(圖1-e、f、g)。

圖1 供試小鼠的剖檢癥狀 Fig.1 Autopsy symptoms of the studied mice

2.2 真菌逆培養(yǎng)結(jié)果

結(jié)合文獻(xiàn)[6]中采用的方法，確定引起小鼠感染的是本次接種的枝孢樣枝孢霉(圖2)。

圖2 枝孢樣枝孢霉菌絲和孢子的顯微特征 Fig.2 Microcharacteristics of hyphae and spore of C. cladosporioides

2.3 小鼠組織病理學(xué)觀察結(jié)果

由圖3 可知，對照組小鼠的病理學(xué)結(jié)果無異常。 試驗(yàn)組小鼠組織切片前8 天無異常(圖4-a、b)；第9～10 天出現(xiàn)表皮粗糙，表皮基底細(xì)胞層局部液化，角質(zhì)層內(nèi)和表皮內(nèi)可見孢子，真皮淺層周圍出現(xiàn)小灶狀浸潤并發(fā)多種細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，并出現(xiàn)一些膿腫(圖4-c、d)；第11～25 天，HE 染色下觀察發(fā)現(xiàn)由上皮樣細(xì)胞、組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)成的肉芽腫，浸潤蔓延至脂肪層，PAS 染色下肉芽腫內(nèi)偶見分枝的菌絲體(圖4-e、f)；第26～30 天，PAS染色下觀察發(fā)現(xiàn)在膿腫、炎癥部、脂肪層浸潤部有多核巨噬細(xì)胞吞噬的菌體和各形孢子，且浸潤處皮脂腺毛囊出現(xiàn)嚴(yán)重破損，偶見異色條帶(圖4-g、h)。

圖3 對照組小鼠的病理組織學(xué)特征 Fig.3 Histopathological features of the control group

圖4 試驗(yàn)組小鼠的病理組織學(xué)特征 Fig.4 Histopathological features of the tested group

如表1 所示，接種后第1～3 天小鼠免疫細(xì)胞數(shù)快速減少，之后緩慢下降，直至第8 天降至最少，表明機(jī)體為了清除感染的真菌而動用機(jī)體免疫細(xì)胞，機(jī)體與該菌處于相持階段，即潛伏期，第9～13天免疫細(xì)胞快速增多至頂峰，第14 天開始逐步呈波動性下降趨勢，至第17 天后趨于平穩(wěn)；接種第1、2 天小鼠體內(nèi)枝孢樣枝孢霉孢子快速減少，第3～16天緩慢減少，維持在相對平穩(wěn)的水平，第17 天急劇增多達(dá)到1 個小高峰之后逐漸減少至第22 天，第23 天又開始緩慢增長，第25 天突然增多又達(dá)到1個小高峰后快速減少，第28天之后未觀察到孢子；接種第1 天菌絲數(shù)量較高，第2 天快速減少后緩慢減少至第5 天，第6 天跳躍式增多后至第12 天趨于穩(wěn)定，第13 天再減少至消失，第13～15 天均未觀察到菌絲，第16～17 天快速增多達(dá)到1 個小高峰后又快速減少至第21 天，第21～24 天均未觀察到菌絲，第25 天出現(xiàn)大量菌絲，數(shù)量達(dá)到最高，第26 天后菌絲快速減少，第27 天后未觀察到菌絲。

表1 枝孢樣枝孢霉感染小鼠后不同時期病理切片中免疫細(xì)胞與菌絲和孢子數(shù) Table 1 The number of immune cells, mycelia and spores in the pathological sections of mice infected with C. cladosporioides

3 討論

一般來說，傳染病的病程發(fā)展大致可以分為潛伏期、前驅(qū)期、明顯(發(fā)病)期和轉(zhuǎn)歸(恢復(fù))期4 個階段[14]。潛伏期指的是從病原體侵入并繁殖開始，到癥狀出現(xiàn)為止的這段時間。本試驗(yàn)中，菌懸液注入小鼠體內(nèi)后，第1～8 天枝孢樣枝孢霉逐漸被機(jī)體的免疫細(xì)胞識別并吞噬，同時枝孢樣枝孢霉也啟動自身的防衛(wèi)機(jī)制，以逃避被機(jī)體的免疫系統(tǒng)吞噬或清除，前8 天小鼠體況正常，接種部位無異常表現(xiàn)，可視為潛伏期。傳染病的潛伏期時間長短差異由具體微生物的種類和數(shù)量決定，同時還與動物的種類和免疫狀態(tài)有關(guān)。在預(yù)試驗(yàn)中，小鼠兩側(cè)注射液體積為0.1 mL，在預(yù)定試驗(yàn)時間中大部分小鼠未發(fā)病或發(fā)病體征不明顯，解剖后也未見明顯病理變化；因此，在正式試驗(yàn)中增加了注射量。通常情況下，慢性及癥狀不明顯的傳染病潛伏期時間長短差異較大且無規(guī)律，急性傳染病則恰恰相反。同種傳染病，如果潛伏期比較短，一般來說疾病癥狀會比較嚴(yán)重；若潛伏期較長時，疾病癥狀則會比較輕緩。處于潛伏期中的動物是最危險的傳染來源，必須對其密切關(guān)注。

前驅(qū)期是疾病的征兆階段。一般來說當(dāng)疾病處于前驅(qū)期時患病動物的臨床癥狀初顯，主要包括體溫升高、食欲不振、精神異常等常規(guī)癥狀，特征性癥狀不明顯，這些癥狀不能確診動物所患疾病[14]。本試驗(yàn)第9～10 天接種部位出現(xiàn)小面積紅斑，皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀損傷，但并未影響到主要器官，未使各器官之間粘連，小鼠也并未有明顯瘙癢等癥狀，可視為前驅(qū)期。第9～13 天免疫細(xì)胞明顯增多，并在第13 天達(dá)到頂峰，而菌絲和孢子數(shù)逐漸減少。具體病例不同，前驅(qū)期的長短也會不同，一般病癥的前驅(qū)期只有幾小時。

疾病度過前驅(qū)期后，特征性癥狀會慢慢的明顯起來，這個階段是疾病愈演愈烈的重要時期，稱為發(fā)病期[14]。因發(fā)病期很多有代表性的特征性癥狀相繼出現(xiàn)，很容易診斷出具體病癥[15]。本試驗(yàn)第11～25 天接種部位紅斑面積增大，并且結(jié)節(jié)狀皮膚損傷深，接種處顏色變深，疑似潰瘍性皮損傷，觸感有增生物，小鼠開始有搔癢動作，飲食明顯減少等癥狀明顯，可視為明顯發(fā)病期。第14～15 天免疫細(xì)胞數(shù)下降，但仍處于高水平，此時孢子和菌絲數(shù)下降到最少；第16～17 天免疫細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)輕微波動，孢子和菌絲數(shù)急劇增多，同時免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膿腫更為明顯。這可能是小鼠體內(nèi)免疫細(xì)胞與真菌發(fā)生劇烈反應(yīng)的過程，小鼠機(jī)體被消耗，免疫系統(tǒng)被攻擊，之后免疫細(xì)胞數(shù)趨向平緩，孢子數(shù)與菌絲數(shù)逐漸下降，孢子數(shù)在第21～24 天趨于穩(wěn)定，這期間也未觀察到菌絲。

膿腫往往是由于微生物感染機(jī)體以后，炎癥組織在微生物產(chǎn)生的毒素或酶的作用下發(fā)生壞死、溶解，形成膿腔，腔內(nèi)的滲出物、壞死組織、膿細(xì)胞和細(xì)菌或真菌等共同組成膿液[16]，由此膿腫逐漸產(chǎn)生。推測小鼠的膿腫可能為壞死溶解的肌肉組織和免疫細(xì)胞。目前，真菌引起膿腫的病例越來越多[17]。本試驗(yàn)中產(chǎn)生的膿腫與鄭文愛等[18]報道的極細(xì)枝孢霉引起的罕見足踝部膿腫樣感染相似。肉芽腫是由巨噬細(xì)胞及其演化的細(xì)胞局限性浸潤和增生所形成的界限清晰的結(jié)節(jié)狀病灶。在此期間逐漸出現(xiàn)肉芽腫，由于免疫細(xì)胞的減少，推測可能是巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肉芽腫。本病例所產(chǎn)生的肉芽腫與桑紅等[19]報道的一致。

疾病度過發(fā)病期后會逐漸發(fā)展進(jìn)入轉(zhuǎn)歸期，在這個階段如果病原體的致病能力増強(qiáng)或動物體的抵抗力降低，那么整個傳染過程以動物死亡為轉(zhuǎn)歸；相反，如果病原體的致病能力減弱或者動物體的抵抗力增強(qiáng)，則動物可逐漸恢復(fù)健康，臨床表現(xiàn)為特殊性癥狀逐步消失，臨床癥狀慢慢減緩，體內(nèi)的病理變化逐漸減弱，正常的生理機(jī)能逐步恢復(fù)。動物體會在一段時間里保留其免疫學(xué)特性，病后一定時間內(nèi)還會有帶菌(毒)、排菌(毒)現(xiàn)象，但最后病原體會被逐漸消滅[14]。第26～30 天接種部位皮膚損傷更深入，有竇道形成，甚至出現(xiàn)局部壞死，增生物觸感更加明顯，出現(xiàn)黏膜粘連，可視為轉(zhuǎn)歸期。第25 天，孢子菌絲數(shù)突然急劇升高，一直到第27天又快速下降，之后孢子菌絲沒再出現(xiàn)，很可能是到達(dá)了轉(zhuǎn)歸期。

李靜[20]的研究中，紅色毛癬菌在小鼠足部組織進(jìn)行長達(dá)21 d 的感染，小鼠足部組織可見表皮過度角化，真皮內(nèi)形成肉芽腫，內(nèi)有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎細(xì)胞浸潤，同時還可見大片區(qū)域壞死，本試驗(yàn)中枝孢樣枝孢霉侵染小鼠腹部表皮明顯發(fā)病期與其類似。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)公鼠普遍發(fā)病情況較母鼠嚴(yán)重，肉芽腫范圍更大，浸潤更深，黏膜粘連更嚴(yán)重，可能與性激素調(diào)控有關(guān)，但還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。李靜[20]還發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌感染小鼠后，經(jīng)PAS 染色后發(fā)現(xiàn)大量分隔菌絲，本次試驗(yàn)也與其類似，但時間上紅色毛癬菌接種21 d 后才觀察到明顯發(fā)病期的病理結(jié)果，表明枝孢樣枝孢霉的致病力可能強(qiáng)于紅色毛癬菌。

4 結(jié)論

枝孢樣枝孢霉對小鼠有明顯的侵染過程，潛伏期為第1～8 天，該時期體表特征變化不明顯；前驅(qū)期為第9～10 天，該時期接種部位出現(xiàn)小面積紅斑，皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀損傷；發(fā)病期為第11～25 天，該時期接種部位紅斑面積增大，損害加大，顏色變深，觸感有增生物，小鼠搔癢，飲食減少；之后屬于轉(zhuǎn)歸期，小鼠飲食持續(xù)減少，接種部位出現(xiàn)局部壞死、粘連等癥狀，并隨時間推移癥狀加重。