云南玉溪冰糖橙果斑病致病菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

桂瑤，胡軍華*，張蓉，資莉玲，施云庭

(1.西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，重慶 400712；3.農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，重慶 400712；4.云南玉溪柑橘研究所，云南 玉溪 653100)

莖點(diǎn)霉屬(Phoma)真菌侵染多種作物，造成葉斑、果斑、果腐及莖枯等癥狀，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量[1]，多種莖點(diǎn)霉已被列為中國(guó)檢疫性病害。目前發(fā)現(xiàn)莖點(diǎn)霉屬真菌寄主植物主要有西番蓮、草莓、楊梅、茄子、天麻、香龍血樹(shù)、青麻、田旋花以及鳳梨科、棕櫚科和竹芋科等10余科植物。多喙莖點(diǎn)霉(Phoma multiostrata)侵染多花筋骨草引起黑脛病[1]，導(dǎo)致植物整株枯萎死亡；南方莖點(diǎn)霉(Phoma jolyana)引起香蕉鞘腐病[2]；草莖點(diǎn)霉(Phoma herbarum)侵染玄參[3]，導(dǎo)致葉斑病的發(fā)生；苜蓿莖點(diǎn)霉(Phoma asparage)侵染黃芩，引起黃芩發(fā)生莖枯病[4]。1991年，陳慈相等[5]首次報(bào)道Phomasp.引起柑橘病害。

云南省玉溪地區(qū)是極早熟柑橘產(chǎn)區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2017 年，玉溪地區(qū)柑橘種植面積達(dá)1.47 萬(wàn)hm2, 產(chǎn)量約30 萬(wàn)t[6], 冰糖橙種植面積占柑橘種植面積的1/3。2016 年夏季至2017 年秋季，玉溪柑橘研究所工作人員觀察到冰糖橙果實(shí)出現(xiàn)一種新型病斑，發(fā)病果實(shí)在幼果期出現(xiàn)針狀的紅褐色斑點(diǎn)，這種斑點(diǎn)隨果實(shí)長(zhǎng)大逐漸擴(kuò)展，轉(zhuǎn)變成黑褐色。筆者調(diào)查10 個(gè)冰糖橙果園，發(fā)現(xiàn)冰糖橙果實(shí)患病率達(dá)30%以上，采用代森錳鋅、?！じｄ\等防控柑橘炭疽病的藥劑進(jìn)行防治，效果不佳。為明確這種新型果斑病病原，找到有效防控藥劑，筆者于2017 年10 月采集典型病果，對(duì)病原進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了室內(nèi)防治藥劑的篩選，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

2017年10月，在云南玉溪采集冰糖橙病果，另從西南大學(xué)柑橘研究所采摘健康冰糖橙葉片和果實(shí)。3%噻霉酮可濕性粉劑、11.5%吡唑嘧菌酯懸浮劑、22.5%咪鮮胺水乳劑、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、50%甲基硫菌靈懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、16%二氰·吡唑酯水分散粒劑、60%霜脲·嘧菌酯可濕性粉劑、40%多菌靈可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、80%代森錳鋅可濕性粉劑等11種藥劑為市售。

1.2 方法

1.2.1 果斑病病原菌菌株的分離與純化

采用組織分離法[7]分離果斑病致病菌，并進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化菌株于4 ℃保存，備用。

1.2.2 菌株致病性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]和[9]的方法，測(cè)定致病菌的致病性。將健康的冰糖橙葉片與果實(shí)用75%乙醇浸泡60 s后，無(wú)菌水沖洗3次，自然風(fēng)干，用接種針針刺10針，接種分離株菌餅(25 ℃光照培養(yǎng)7 d的分離株菌餅、直徑6 mm)，以接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的葉片和果實(shí)為對(duì)照。接種2 d后移去菌餅，每隔2 d觀察葉片發(fā)病情況，記錄病狀并拍照。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定

將病原菌分別接種在PDA、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)、麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況，記錄菌落形態(tài)和顏色，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。觀察、記錄菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子以及菌絲的形態(tài)特征。參照AVESKAMP[10]方法，將病原菌接種到OA、MEA 培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)7 d，在菌落邊緣滴加1 mol/L 的NaOH，處理后每隔10 min 觀察培養(yǎng)基的顏色變化情況，直至培養(yǎng)基不變色為止。

分離菌株培養(yǎng)7 d 后，采用植物基因組DNA 提取試劑盒(天根公司)提取DNA，對(duì)核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因、β-微管蛋白(tub2)基因、細(xì)胞延伸因子基因(EF1-α)、線粒體小亞基核糖體DNA(SSU)、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物(表1)由華大基因公司合成。50 μL PCR 反應(yīng)體系：0.4 μmol/L 引物、3 ng 總DNA 模板和25 μL 2XT5Super PCR Mix，用雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s, 55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，最后72 ℃補(bǔ)充延伸2 min。4 ℃保存，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后送華大基因公司測(cè)序。將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA7.0 軟件鄰近法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000 次重復(fù))。

表1 采用的引物及其序列 Table 1 Primers and sequences used in this study

1.2.4 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法[16]測(cè)定11 種殺菌劑對(duì)分離菌株的毒力大小。運(yùn)用PBT 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)各藥劑試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得各殺菌劑對(duì)菌株的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50、EC90(μg/mL)和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰糖橙果斑病癥狀及致病菌的致病性

2016年，調(diào)查發(fā)現(xiàn)冰糖橙果實(shí)上開(kāi)始出現(xiàn)紅棕色針狀小斑點(diǎn)，背面為黃褐色病斑，邊緣有黃褐色的暈圈(圖1)，隨著病害逐漸加重后會(huì)逐漸擴(kuò)大為橢圓形、圓形或者不規(guī)則的黑褐色病斑，直徑1～6 mm。2018年，病果率已超過(guò)30%。果實(shí)上的病斑較多，葉片和枝條上發(fā)生較少。2017至2019年，從病果樣品中分離得到真菌，其中莖點(diǎn)霉屬真菌分離比例達(dá)90%。

圖1 冰糖橙新型果斑病果實(shí)癥狀 Fig.1 Symptom of Bingtang orange with a new type fruit spot

用分離的致病菌菌株NS2-2、NS2-6、guo-1針刺接種菌餅法處理健康冰糖橙葉片和果實(shí)，7 d和14 d后調(diào)查顯示對(duì)照葉片和果實(shí)未發(fā)病，接種的發(fā)病率為100%，接種后初期病斑呈不規(guī)則水漬狀淺褐色，逐漸擴(kuò)展成圓形黑褐色大病斑，5 d后病斑直徑達(dá)到10～20 mm，10 d后病斑面積占果實(shí)或葉片面積的近1/2(圖2)。從發(fā)病葉片和果實(shí)上分離致病菌，所獲分離株的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀與菌株NS2-2、NS2-6、guo-1完全一致。

2.2 果斑病致病菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征

圖3顯示，guo-1、NS2-2、NS2-6菌株在PDA培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈絨狀；菌落呈圓形，邊緣整齊，生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生色素，生長(zhǎng)初期菌落呈白色，后變?yōu)榉凵笃诔食嗉t色；在OA培養(yǎng)基上菌落初為乳白色，后變?yōu)楹稚?，菌絲埋生，分支，具隔膜，生長(zhǎng)相對(duì)遲緩，氣生菌絲發(fā)達(dá)，培養(yǎng)7 d后菌落具有不同程度的菌絲膨脹；在MEA培養(yǎng)基上菌落邊緣整齊，并產(chǎn)生少量氣生菌絲，菌落呈乳白色。

經(jīng)近紫外線照射培養(yǎng)后，病原菌可在PDA 培養(yǎng)基上生成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，菌絲無(wú)色至淺黃色，分枝，分隔(圖4)。在培養(yǎng)基菌落表面或培養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)生黑褐色分生孢子器，呈球形或近球形，直徑為70～130 μm，多數(shù)散生，少數(shù)聚生，具乳突狀孔口，產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶梗狀。分生孢子呈橢圓形或圓形，無(wú)色，單孢，平均大小為(2～2.5) μm×(4.1～5.4) μm，長(zhǎng)寬比為2.1～3.2；老化的孢子含有1～2 個(gè)隔膜，稍帶暗褐色。

圖3 致病菌株在PDA、MEA、OA 上培養(yǎng)的形態(tài)特征 Fig. 3 Morphological characteristic of isolated strains guo-1, NS2-2, NS2-6 on OA, MEA, PDA culture media

圖4 PDA 培養(yǎng)基上guo–1 菌株的菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子 Fig. 4 Characteristic of mycelium, pycnidiums and conidium from strain guo-1 on PDA medium

將菌株guo-1接種到OA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，在菌落邊緣滴加1 mol/L NaOH，10 min后，OA培養(yǎng)基變成綠色，2 h后OA培養(yǎng)基逐漸變紅，可判斷guo-1菌株在OA培養(yǎng)基上NaOH反應(yīng)為陽(yáng)性，符合莖點(diǎn)霉屬真菌的NaOH顏色反應(yīng)特征。根據(jù)菌株在PDA、OA、MEA培養(yǎng)基上的菌落、分生孢子器、分生孢子等形態(tài)學(xué)特征以及NaOH顏色反應(yīng)， 參照《中國(guó)真菌志球殼孢目莖點(diǎn)霉屬、葉點(diǎn)霉屬》[17]和《PhomaIdentification Manual》[1]的描述，初步鑒定這3個(gè)菌株為無(wú)性孢子類、球殼孢目、莖點(diǎn)霉真菌(Phomasp.)。

對(duì)分離菌株的ITS、LSU、SSU、TUB、EF1-α和ACT基因進(jìn)行測(cè)序分析，將擴(kuò)增的序列分別提交至GenBank，利用Blast對(duì)分離菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，3個(gè)分離株的ITS與Phomasp.菌株同源性最高，具有98.51%的同源性，這3個(gè)分離株的LSU與Phomasp.菌株同源性為 98.98%，SSU序列與Phomasp.菌株的同源性為97.89%，TUB序列與Phomasp.菌株的同源性為99.49%，EF1-α與Phomasp.菌株的同源性為97.74%，ACT序列與Phomasp.菌株的同源性為 97.39%。表明分離菌株與多個(gè)莖點(diǎn)霉屬(Phomasp.)菌株一致性達(dá)到99%以上。多基因聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，分離菌株與莖點(diǎn)霉屬菌株(Phomasp.)聚為一支，說(shuō)明它們?yōu)榍o點(diǎn)霉屬真菌(圖5)。

圖5 致病菌菌株基于ITS、SSU、TUB、EF1–α、ACT 合并序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.5 Phylogenetic tree of strains guo-1,NS2-2 and NS2-6 constructed by neighbor joining method based on ITS, SSU, TUB, EF1 - α and ACT combined sequences

2.3 殺菌劑對(duì)致病菌株的毒力

殺菌劑對(duì)分離菌株的毒力結(jié)果(表2)表明，3%噻霉酮、11.5%吡唑嘧菌酯、22.5%咪鮮胺、60%唑醚·代森聯(lián)、50%甲基硫菌靈的EC50均低于1.000 0 μg/mL，說(shuō)明這5種藥劑對(duì)菌株guo-1的毒力活性最強(qiáng)，抑菌效果較好；75%肟菌·戊唑醇、16%二氰·吡唑酯、60%霜脲·嘧菌酯、40%多菌靈、70%丙森鋅的EC50值大于1.000 0，小于11.000 0，表明這些藥劑對(duì)菌株guo-1具有一定的毒力作用，但效果一般；80%代森錳鋅則對(duì)guo-1幾乎無(wú)抑菌作用。

表2 殺菌劑對(duì)分離菌株的抑菌作用 Table 2 Antibacterial effect of different fungicides on the isolated strains

3 結(jié)論與討論

采用組織分離法，從云南玉溪冰糖橙病斑上分離得到3株較強(qiáng)致病性真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定和致病力測(cè)定，確定致病菌為莖點(diǎn)霉(Phomasp.)。菌株對(duì)3%噻霉酮可濕性粉劑和11.5%吡唑嘧菌酯懸浮劑、22.5%咪鮮胺水乳劑、60%唑醚·代森聯(lián)水分散聯(lián)劑非常敏感，可進(jìn)一步進(jìn)行大田試驗(yàn)。常規(guī)保護(hù)藥劑80%代森錳鋅可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、40%多菌靈可濕性粉劑等對(duì)致病菌的抑制效果差，建議田間減少使用。

Phomasp.可侵染多寄主，致病力較強(qiáng)，有擴(kuò)展的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加大監(jiān)測(cè)力度，在室內(nèi)藥劑篩選的結(jié)果上盡快開(kāi)展田間試驗(yàn)，為病害防控提供有效藥劑。防控藥劑也要加強(qiáng)針對(duì)性，防止病害擴(kuò)展。目前，莖點(diǎn)霉屬真菌在田間經(jīng)常出現(xiàn)變種，鑒定難度非常大，此次在柑橘上鑒定到的莖點(diǎn)霉有可能是莖點(diǎn)霉屬新種, 但還需要進(jìn)行后續(xù)的鑒定。