湖南常德地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的鑒定及其寄主分析

張?jiān)婈?，蔡海林，張瀟筱，楊中俠*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南省煙草公司長沙市公司，湖南 長沙 410011)

草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda(Smith))屬鱗翅目(Lepidoptera)、夜蛾科(Noctuidae)，原產(chǎn)美洲，為害包括禾本科、豆科在內(nèi)的76 科353 種植物[1-2]。該蟲于2019 年1 月入侵中國云南省，至10 月已擴(kuò)散至26個(gè)省、市(自治區(qū))，危害面積超過100萬hm2，并呈持續(xù)擴(kuò)散的趨勢(shì)[3-5]。草地貪夜蛾因取食寄主植物的不同，分化出玉米型和水稻型2 種亞型。玉米型草地貪夜蛾偏向取食玉米、花生等，水稻型則偏向取食水稻和各種牧草等[6-7]。據(jù)預(yù)測(cè)，草地貪夜蛾為害造成中國玉米的潛在經(jīng)濟(jì)損失總量約為374.77～3 306.35 億元[8]。目前暫未發(fā)現(xiàn)入侵的水稻型草地貪夜蛾[9]。

顧偌鋮等[10]和唐運(yùn)林等[11]發(fā)現(xiàn)，重慶不同地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的種類和結(jié)構(gòu)有差異；徐天梅等[12]發(fā)現(xiàn)，采自云南兩個(gè)不同地區(qū)的草地貪夜蛾腸道不可培養(yǎng)細(xì)菌種類的優(yōu)勢(shì)菌屬種類卻有一定的相似性。

筆者對(duì)采自湖南常德地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并將其與玉米粘蟲幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行了比較。觀察草地貪夜蛾幼蟲在玉米、辣椒、甘藍(lán)及豇豆幾種植物上的存活率，探討其對(duì)寄主植物的潛在危害性，以期為防控草地貪夜蛾提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019 年5 月，在湖南常德田間玉米地，采集4齡草地貪夜蛾幼蟲，在長沙采集玉米粘蟲幼蟲，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以嫩玉米飼喂。

1.2 方法

1.2.1 草地貪夜蛾和玉米粘蟲腸道細(xì)菌的分離純化

取草地貪夜蛾和玉米粘蟲4 齡幼蟲各15 頭，禁食24 h 后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)用75 %的乙醇浸泡2 min，以二次滅菌純水漂洗2 次。使用解剖刀取出幼蟲腸道組織，放入盛有200 μL PBS 溶液的滅菌塑料離心管(1.5 mL)中，用滅菌研棒研磨成勻漿液，補(bǔ)足至1 mL。

為使腸壁上的細(xì)菌可以充分釋放到勻漿液中，將組織勻漿液于37 ℃下靜置1 h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將其連續(xù)稀釋102、103、104倍，每個(gè)平板加入100 μL 稀釋液。參照文獻(xiàn)[13]研究方法并加以改進(jìn)，在LB、NA、EC、SS、PDA 培養(yǎng)基[14]培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基空白對(duì)照涂布PBS 溶液。于37 ℃黑暗培養(yǎng)24～48 h，依據(jù)細(xì)菌基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)特征，分離細(xì)菌菌落，并對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行純化。

1.2.2 草地貪夜蛾和玉米粘蟲腸道細(xì)菌16S rDNA鑒定

將分離得到的細(xì)菌單菌落進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增使用 16S rDNA 通用引物 27F，序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'及 1492R:5'- GGCTACCTTGTTACGACTT-3'[15]。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min；53 ℃退火 45 s；72 ℃延伸 1 min；循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用試劑盒進(jìn)行DNA 膠回收(OMEGA: Gel Extraction Kit)；將膠回收的產(chǎn)物連接至T 載體，并與感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后送上海生物工程有限公司測(cè)序。序列于NCBI(https://www.ncbi. nlm.nih.gov)上進(jìn)行比對(duì)以確定細(xì)菌種類。

1.2.3 草地貪夜蛾幼蟲在寄主植物上的存活情況

取草地貪夜蛾同日齡卵，待其孵化為幼蟲后，于玉米葉上飼養(yǎng)至3 齡，各取30 頭，分別放入有嫩玉米、辣椒、豇豆及甘藍(lán)葉片的器皿中飼養(yǎng)，每日清理并更換植物，飼養(yǎng)至化蛹。老熟幼蟲化蛹后，及時(shí)收集蛹。觀察幼蟲的存活率、發(fā)育狀況及發(fā)育歷期。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的鑒定結(jié)果

將草地貪夜蛾幼蟲的腸道提取物用5 種培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到了11 株細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA 分子鑒定，歸屬于腸桿菌屬、泛菌屬、萊略特氏菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬5 個(gè)屬；將玉米粘蟲幼蟲的腸道提取物培養(yǎng)后，得到了10 株細(xì)菌，歸屬于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、戴爾福特菌屬5 個(gè)屬(表1)。

表1 不同培養(yǎng)基下草地貪夜蛾與玉米粘蟲的腸道細(xì)菌可培養(yǎng)種類 Table 1 Intestinal bacteria identified in larvae gut of Spodoptera frugiperda and Mythimna separate

草地貪夜蛾腸道細(xì)菌分別為腸桿菌屬(Enterobacter)神戶腸桿菌(Enterobacter kobei)、腸桿菌(Enterobactersp.)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)、生癌腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)；泛菌屬(Pantoea)泛菌(Pantoeasp.)；萊略特氏菌屬(Lelliottia)萊略特氏菌(Lelliottia nimipressuralis)；芽孢桿菌屬(Bacillus)芽孢桿菌(Bacillussp.)及克雷伯氏菌屬(Klebsiella)克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、佛里德蘭德氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)。NA 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種類多于其他培養(yǎng)基的。

玉米粘蟲幼蟲腸道細(xì)菌分別為腸桿菌屬腸桿菌(Enterobactersp.)、阿氏腸桿菌、生癌腸桿菌、霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)；克雷伯氏菌屬克雷伯氏菌、佛里德蘭德氏桿菌；芽孢桿菌屬蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)；腸球菌屬(Enterococcus)蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)；戴爾福特菌屬(Delftia)戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)。SS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種類多于其他培養(yǎng)基的。EC 培養(yǎng)基培養(yǎng)未得到玉米粘蟲腸道細(xì)菌。

草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌與玉米粘蟲的相比，在門以及屬分類組成上比較相似，均有腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬，且優(yōu)勢(shì)種均為腸桿菌屬(圖1)，但可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬有差異：萊略特氏菌屬與泛菌屬僅在草地貪夜蛾幼蟲腸道中提取得到，腸球菌屬與戴爾福特菌屬僅在玉米粘蟲幼蟲腸道中提取得到。

圖1 草貪夜蛾和玉米粘蟲幼蟲腸道細(xì)菌菌屬占比 Fig.1 The proportion of intestinal bacteria in larvae gut of Spodoptera frugiperda and Mythimna separate

2.2 草地貪夜蛾幼蟲在不同植物上的存活率

觀察發(fā)現(xiàn)，玉米是常德草地貪夜蛾幼蟲的主要寄主。草地貪夜蛾幼蟲在玉米植株上的存活率約為70%；在豇豆上的存活率約為50%；在辣椒和甘藍(lán)植株上僅有少數(shù)能夠存活，幼蟲存活率分別僅為17%和10%(圖2)。

圖 2 草地貪夜蛾幼蟲在寄主植物上的存活率 Fig.2 Larval survival rate of Spodoptera frugiperda

3 結(jié)論與討論

昆蟲腸道微生物種類和功能因食物、生存環(huán)境、地理位置及氣候的不同而有差異，處于相同地域、取食同種食物的不同種昆蟲之間的腸道微生物也會(huì)存在較大差異[16-20]。不同地區(qū)的同種昆蟲腸道微生物的種類與結(jié)構(gòu)也可能有較高的相似性[12]。

將常德地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌種類與重慶江津地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌的進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)常德種群中培養(yǎng)得到了重慶種群中所未培養(yǎng)得到的克雷伯氏菌屬、泛菌屬及萊略特氏菌屬；常德種群未培養(yǎng)得到重慶種群中的不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；2個(gè)種群均培養(yǎng)得到了腸桿菌屬。這可能與使用的培養(yǎng)基有關(guān)，重慶種群培養(yǎng)僅使用LB 培養(yǎng)基，而本研究中使用了LB、NA、EC、SS、PDA5 種培養(yǎng)基，因而多分離出幾種菌屬。

將常德草地貪夜蛾腸道細(xì)菌與云南省蒙自地區(qū)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌[21]作比較，發(fā)現(xiàn)2 種群均可培養(yǎng)得到克雷伯氏菌屬；但常德種群培養(yǎng)得到了云南種群所未檢測(cè)到的萊略特氏菌屬、泛菌屬與芽孢桿菌屬；未提取到腸球菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)及摩根菌屬(Morganella)。由此可見，不同地區(qū)草地貪夜蛾腸道微生物的種類差異較大，這種差異可能與腸道細(xì)菌鑒定方法及草地貪夜蛾的生存環(huán)境有關(guān)。

有研究表明，采自同一地區(qū)、取食同種寄主(玉米)的鱗翅目昆蟲，幼蟲的腸道微生物的可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬相同，盡管菌種稍有差異，但菌群組成相似度卻很高，推測(cè)與其取食食料相似以及均歸屬于鱗翅目有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，采自不同地區(qū)的玉米粘蟲(長沙)與草地貪夜蛾(常德)幼蟲，可培養(yǎng)的腸道微生物種類呈一定的相似性，均可培養(yǎng)得到生癌腸桿菌、佛里德蘭德氏桿菌、阿氏腸桿菌、腸桿菌和克雷伯氏菌，推測(cè)其與草地貪夜蛾和玉米粘蟲取食相同寄主及同屬于相同的目和科有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾幼蟲在玉米、豇豆、甘藍(lán)、辣椒上均可存活，在玉米上的存活率最高，可達(dá)70%；在豇豆上幼蟲存活率約為50%，表明其在豇豆上也能正常發(fā)育，推測(cè)豇豆是草地貪夜蛾的潛在寄主。最近的研究[23]表明，草地貪夜蛾已在浙江為害甘藍(lán)。從本研究的結(jié)果來看，甘藍(lán)也是湖南草地貪夜蛾的潛在寄主。