檸檬苦素類化合物抗病原體作用及機制研究進展

張群琳，何雅靜，李 甜，孫志高,2*

1西南大學柑桔研究所；2中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712

檸檬苦素類化合物是一類主要存在于蕓香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物中[1]的三萜類次生代謝產(chǎn)物，其中，在蕓香科植物(如檸檬、甜橙、葡萄柚、佛手柑)的種子、果實和果皮組織中含量豐富，并與柑橘品種有關(guān)[2]；楝科植物中的印度楝樹含檸檬苦素類化合物種類最多[3]。目前已經(jīng)從蕓香科和楝科植物中分別發(fā)現(xiàn)了130余種該類化合物[4-6]。國內(nèi)外學者對檸檬苦素類化合物的生理活性進行大量研究，發(fā)現(xiàn)檸檬苦素類化合物具有抗癌[7,8]、抗菌、抗病毒[9]、抗氧化和殺蟲[10,11]等生理活性。檸檬苦素配糖體大多溶于水溶液，具有預防骨質(zhì)疏松[12,13]和抗肥胖[14,15]作用，且在pH2～8范圍內(nèi)穩(wěn)定、無味，因此被廣泛應用于傳統(tǒng)藥物[16,17]或作為膳食補充劑應用于現(xiàn)代營養(yǎng)制品[18]中。

近年來由于抗生素的不當使用，逐漸產(chǎn)生了耐藥菌株，抗菌藥物的療效和安全性呈現(xiàn)降低的趨勢，利用檸檬苦素類化合物的抗菌活性，將其作為一種天然的抗病原體物質(zhì)具有很好的應用潛能和研究價值。本文就檸檬苦素類化合物結(jié)構(gòu)、其對病原體的影響及作用機理和檸檬苦素類物質(zhì)的吸收代謝情況等進行綜述，旨在為檸檬苦素類化合物于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)應用提供一定的理論參考。

1 檸檬苦素類化合物的結(jié)構(gòu)特性

檸檬苦素類化合物是高度氧化的三萜類化合物，其特征在于含有呋喃環(huán)的四環(huán)三萜類骨架。按化學骨架和環(huán)開裂情況，主要分為四環(huán)均完整型(intact apo-euphol skeleton limonoid)、A-環(huán)開環(huán)(A-ring seco limonoid)、B-環(huán)開環(huán)(B-ring seco limonoid)、C-環(huán)開環(huán)(C-ring seco limonoid)、A，D-環(huán)開環(huán)型(A,D-ring seco limonoid)等[5]，詳見圖1。

圖1 各組檸檬苦素類化合物骨架圖

蕓香科植物中檸檬苦素類化合物主要以游離苷元和相應的β-D-葡萄糖苷形式存在，前者主要在種子中形成，后者在果實成熟過程中形成。檸檬苦素苷元類化合物(1～10)的主要的官能團為雙內(nèi)酯[20]，包括檸檬苦素(limonin，1)、諾米林(nomilin，2)、黃柏酮(obacunone，3)、脫乙酰諾米林(deacetylnomilin，4)、limonexic acid(5)、isolimonexic acid(6)、枸櫞苦素(citrusin，7)、宜昌橙苦素(ichangin，8)、異黃柏酮酸(isoobacunoic acid，9)、脫氧檸檬苦素(deoxylimonin，10)詳見圖2和表1。

圖2 檸檬苦素類化合物1～15骨架圖

表1 檸檬苦素苷元類化合物主要結(jié)構(gòu)特征匯總

葡萄糖苷類檸檬苦素類化合物(11～15)是由檸檬苦素苷元在17位和1分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合而形成的，主要官能團為內(nèi)酯、二羧酸[20]，主要包括檸檬苦素17-R-D-glucoside(11)、黃柏酮17-R-D-glucoside(12)、脫乙酰諾米林酸17-R-D-glucoside(13)、諾米林酸17-R-D-glucoside(14)、異黃柏酮酸17-R-D-glucoside(15)，詳見表2。

表2 葡萄糖苷類檸檬苦素化合物主要結(jié)構(gòu)特征匯總

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.名稱Name分子式Molecularformulan′n″R1R2R3R4R5R6XYZ主要官能團Mainfunctionalgroup12Obacunone17-β-D-glucosideC32H42O1311與R3成環(huán)-與R1成環(huán)HOglc1HO-CH=CH內(nèi)酯、羧酸13Deacetylnomilinicacid17-β-D-glucosideC32H46O1521OHOHHHOglc1HO-CH=CH二羧酸14Nomilinicacid17-β-D-glucosideC34H48O1621OHOAcHHOglc1HO-CH=CH二羧酸、乙酸乙酯15Isoobacunoicacid17-β-D-glucosideC32H44O1421 OHHOglc1HO-CH=CH二羧酸

楝科植物的次級代謝產(chǎn)物-檸檬苦素類化合物是該科植物的主要特征成分，楝科植物中檸檬苦素類物質(zhì)是由三萜類或具有4，4，8-三甲基-17-呋喃甾類骨架的前體衍生而來，通過環(huán)氧化作用和apo-euphol或apo-triucallol重組，逐步形成具有較高生物活性的四環(huán)三萜類物質(zhì)[12]。其中苦楝子酮(melianone)、苦楝子醇(melianol)是代表性楝科檸檬苦素類化合物，詳見圖3。

圖3 苦楝子酮和苦楝子醇結(jié)構(gòu)式

2 檸檬苦素類物質(zhì)抗病原體特性

2.1 檸檬苦素類物質(zhì)抗動物源性病原體

2.1.1 抗動物源性致病菌

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌耐藥性逐漸增加。有研究表明，天然產(chǎn)物檸檬苦素類物質(zhì)對李斯特菌、大腸桿菌、結(jié)核分歧桿菌等致病菌具有顯著的抑制作用，所以將其作為一種新型抗菌藥物以解決細菌耐藥性問題，具有一定的研究價值，詳見表3所示。

Rahman等[21]以活菌計數(shù)法測定檸檬苦素對單增李斯特桿菌的抗菌活性，其結(jié)果表明檸檬苦素對ATCC 19116菌株抑制作用最強，最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為15.62 μg/mL，敏感性高于ATCC 19111、19166、19118和15313菌株(MIC：31.25～62.5 μg/mL)。

苦楝果實中含量最豐富的檸檬苦素類化合物為3-α-tigloyl-melianol和苦楝萜酸甲酯，Sanna等[22]的研究表明這兩個化合物具有顯著的抗結(jié)核分歧桿菌活性，其中3-α-tigloyl-melianol活性最高，MIC值為29 μM，其次是苦楝萜酸甲酯，MIC值為70 μM；最重要的是，發(fā)現(xiàn)3-α-tigloyl-melianol使用量在500 μM以下時對Vero細胞沒有細胞毒性，這使其作為抗分歧桿菌劑極具應用價值。

2.1.2 抗動物病毒

迄今為止，多種植物來源的檸檬苦素類化合物已被證實對HIV-1[25,26]、登革熱病毒[27,28]、呼吸道合胞病毒[29]和單純皰疹病毒[30]等具有抗病毒活性，詳見表4所示。

Sanna等[22]研究表明苦楝科苦楝果實中的檸檬苦素類化合物3-α-tigloyl-melianone和苦楝子酮，在半最大效應濃度(EC50)分別為7和3 μM時，對黃熱病病毒均表現(xiàn)出很強的抑制活性。為進一步確定其抗病毒活性，研究將篩選范圍擴大到黃熱病毒屬的其它重要人類病原體，結(jié)果表明兩種物質(zhì)對登革病毒和西尼羅河病毒(west nile virus，WNV)(EC50值在3～11 μM范圍內(nèi))也顯示出一定的抑制活性。

Petrera等[31]的研究也表明，苦楝葉中檸檬苦素1-cinnamoyl-3，11-dihydroxymeliacarpin(CDM)在上皮細胞中具有有效的抗皰疹作用。Balestrieri[26]研究了佛手柑提取物(BSext)、檸檬苦素、諾米林對δ逆轉(zhuǎn)錄病毒人體T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的抑制作用，結(jié)果表明檸檬苦素和諾米林對HTLV-1均有抑制活性，抑制50%逆轉(zhuǎn)錄濃度(RTIC50)分別為0.31±0.01和2.60±0.06 ng/mL。同時發(fā)現(xiàn)BSext、檸檬苦素和諾米林等天然來源化合物的細胞毒性顯著低于參考化合物，且結(jié)果表明，BSext、檸檬苦素和諾米林對HTLV-1和HIV-1的抗感染作用都是源于它們自身的抗病毒作用，而不是其對細胞產(chǎn)生的毒性作用。

2.2 檸檬苦素類物質(zhì)抗植物病原體活性

部分天然植物提取物具有抗真菌毒素及抑制不同植物病原體的重要作用[32]。檸檬苦素類化合物作為三萜類化合物的代表物質(zhì)，研究表明其在一定濃度下足以抵御某些潛在的植物病原菌[33]，因其具有低動物毒性、無神經(jīng)毒性、在環(huán)境中易降解以及避免抗藥性產(chǎn)生等多種優(yōu)勢，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域被認為是防治植物病原菌的有效候選藥物。

Abdelgaleil等[34]研究了從植物大葉卡雅楝中分離出的10種檸檬苦素類化合物對植物病原真菌灰葡萄孢菌的抗真菌活性，結(jié)果表明methyl-angolensate 和1，3，7-trideacetylkhivorin對灰葡萄孢菌的抑菌活性最高，在1000 mg/L時抑菌率分別為62.8%和64.0%，在1500 mg/L時抑菌率分別為73.3%和68.6%。Park等[35]用指示植物法測定了檸檬苦素衍生物anthothecol對銹菌的抑制活性，結(jié)果表明當濃度分別為0.5、0.25、0.1 mg/mL時，抑菌率可達90%、76%和53%。

煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的植物病原體，一些重要的經(jīng)濟作物被其感染后會造成嚴重的經(jīng)濟損失。Ge等[36]通過半葉法研究發(fā)現(xiàn)，當實驗濃度為200 μg/mL時，從單葉地黃連中分離出的8種檸檬苦素類物質(zhì)都具有抗TMV活性，同時酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果顯示，兩種檸檬苦素類物質(zhì)munronoid K和munronoid O在濃度為30 μg/mL時對TMV的復制表現(xiàn)出強烈抑制作用。

3 檸檬苦素類物質(zhì)抗病原體作用機理

3.1 抗致病菌機理

目前研究表明，多種檸檬苦素類化合物能夠通過影響致病菌群體感應(quorum sensing，QS)從而削弱細菌的致病性[37,38]。群體感應是細菌細胞之間交流的重要機制，根據(jù)細菌合成的信號傳遞分子即自誘導劑(autoinducer，AI)和感應機制不同，腸道致病菌使用LuxR/I、LuxS/AI-2和AI-3/腎上腺素介導的幾種群體感應系統(tǒng)來操縱生物膜形成、毒力基因表達等，以在宿主細胞內(nèi)引發(fā)感染并使之持續(xù)[39]。結(jié)合國內(nèi)外的相關(guān)研究，可將檸檬苦素類物質(zhì)的抑細菌機理分為以下幾個方面。

3.1.1 抑制信號分子活性、干擾感應系統(tǒng)

弧菌有3種平行的QS系統(tǒng)，其中系統(tǒng)2是LuxS/AI-2系統(tǒng)，感應器是LuxO[39]。Vikram等[40]通過研究幾種檸檬苦素類化合物對哈氏弧菌細胞信號傳導的抑制潛能，發(fā)現(xiàn)isolimonexic acid是AI-2活性最有效的抑制劑，IC90=38.90 Μm。此外在100 μg/mL濃度下，isolimonexic acid、宜昌橙苦素能夠使調(diào)節(jié)應答調(diào)節(jié)因子LuxO的表達分別下調(diào)3.68、23.7倍，從而抑制細菌細胞信號轉(zhuǎn)導途徑。該作者的另一研究還發(fā)現(xiàn)limonexic acid是大腸桿菌O157:H7信號分子AI-3、腎上腺素和感應器激酶QseBC的有效抑制劑。

3.1.2 影響細菌生物被膜形成

細菌生成生物被膜是其為適應自然環(huán)境有利于生存的一種生命現(xiàn)象，是致病菌的一個病理特征，受到多種影響因子的復雜調(diào)控，包括環(huán)境因素和AI-2、AI-3介導的細胞信號。

Vikram[40]的研究表明檸檬苦素類物質(zhì)能抑制細胞信號，因此，其進一步研究了處理組對致病菌生物膜的影響，結(jié)果表明不同檸檬苦素類化合物對哈維氏弧菌生物膜的抑制活性差異顯著(P<0.05)，isolimonexic acid和黃柏酮在最小抑制濃度分別為94.18和91.2 μM時是哈維氏弧菌生物膜最有效的抑制劑。檸檬苦素類物質(zhì)對大腸桿菌的抑菌活性研究結(jié)果也顯示[37]，isolimonexic acid和黃柏酮是腸出血性大腸桿菌生物膜最有效的拮抗劑，以劑量依賴的方式對其產(chǎn)生抑制，IC25和IC50值分別為19.7和116.68 μM。

3.1.3 抑制細菌毒力基因正常表達

腸出血性大腸桿菌含有多種毒力決定因素，如由LEE基因座操控的粘附抹平病理學效應、stx2編碼的志賀毒素、編碼激活轉(zhuǎn)錄基因flhDC等[41,42]。有學者[40]研究發(fā)現(xiàn)在實驗濃度為100 μg/ml的情況下，isolimonexic acid使LEE區(qū)編碼的基因表達下調(diào)5～10倍，flhD和flhC的表達分別下調(diào)4.5、6.9倍，stx2的表達下調(diào)4.9倍，ichangin同樣能夠不同程度的抑制這三種基因的表達。沙門氏致病島(salmonella pathogenicity islands，SPIs)是沙門氏菌附著和內(nèi)化到腸細胞以及在細胞內(nèi)存活所必需的，研究表明黃柏酮能夠使SPI區(qū)內(nèi)負責編碼TTSS和效應因子的基因ssrA、ssrB表達下調(diào)9.7，11.8倍，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃柏酮(100 μg/mL)處理，沙門氏菌附著于Caco-2細胞上的數(shù)量出現(xiàn)顯著性下降[40]。

3.1.4 對致病菌造成形態(tài)學損傷

Rahman等[23]學者測試了檸檬苦素對單核細胞增生李斯特菌的影響，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組單核細胞增生李斯特菌菌株的形態(tài)沒有任何變化，而處理組顯示這些化合物會造成單核細胞增生李斯特菌的形態(tài)學損傷，如終點腫脹，細胞壁溶解，部分變形，有孔形成等。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬苦素處理的根霉孢子凹陷和皺縮嚴重，檸檬苦素通過破壞根霉細胞壁和細胞膜的完整性，使胞內(nèi)物質(zhì)滲出，菌絲體和孢子變形，從而達到抑菌效果(MIC：1 250 μg/mL)。

3.2 抗病毒機理

3.2.1 抑制病毒入侵宿主細胞

Sanna等[22]通過體外細胞實驗證明檸檬苦素類物質(zhì)3-α-tigloyl-melianol和苦楝子酮對WNV的抑制僅在發(fā)生感染的前1 h內(nèi)有效，如果在病毒感染細胞后的2、4、8 h再添加目標物質(zhì)，則處理組細胞的存活率與對照組相比無顯著提升，同時兩種化合物不能阻止病毒與細胞受體間的識別和附著，所以研究者推測對病毒的抑制發(fā)生在隨后的進入過程。另有研究[44]表明苦楝子提取物(ethanolic extract of Meliae Fructus，EMF)可以有效抑制流感病毒血凝素的活性，從而起到抑制病毒入侵的效果，這是因為血凝素作為流感病毒表面蛋白，與宿主細胞表面的唾液酸受體結(jié)合后能促進病毒侵入胞內(nèi)。

3.2.2 抑制病毒糖蛋白轉(zhuǎn)運

病毒具有有限的遺傳能力，必須依賴宿主細胞的多種功能才能增殖，病毒糖蛋白在核糖體上合成，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基氏體到達細胞膜，在此過程中被糖基化。Barquero等[45]將感染水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)后的宿主細胞經(jīng)CDM處理，間接熒光免疫結(jié)果顯示，合成的病毒G-蛋白被限制于高爾基體上，即CDM抑制了G-蛋白向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運。Bueno等[46]的研究表明，CDM對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)和TNF-α兩種糖蛋白的轉(zhuǎn)運有短暫的阻斷作用，在不影響細胞糖蛋白生物活性的情況下，CDM引起的糖蛋白轉(zhuǎn)運延遲對病毒增殖會產(chǎn)生強烈抑制作用，但CDM對TfR與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合能力沒有影響，對TNF-α的分泌也沒有影響。另一方面，CDM同時干擾了衣殼蛋白、糖蛋白和被膜蛋白在同一HSV-1感染細胞內(nèi)的定位。

3.2.3 抑制病毒復制和部分基因表達

Botticelli等[47]發(fā)現(xiàn)，在人外周血單核細胞(PB-MC)、單核細胞/巨噬細胞培養(yǎng)體系中，檸檬苦素能有效抑制HIV-1的復制且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，EC50為60.0 μmol/L。另一體外細胞實驗[45]表明，分別在VSV病毒感染細胞0～3 h和3～6 h后，向培養(yǎng)基中加入75 μM CDM，對病毒復制的抑制率可分別達到90%和91%。

tax、rex是HTLV病毒基因組的兩個調(diào)節(jié)基因，其中rex基因可表達兩種對病毒結(jié)構(gòu)有調(diào)節(jié)作用的蛋白。Balestrieri[26]研究結(jié)果表明，佛手柑提取物(BSext)和諾米林在用量10 μg/mL時能完全抑制HTLV-1 tax/rex的表達，檸檬苦素在5 μg/mL濃度下也達到抑制HTLV-1/rex表達的效果，此外研究表明檸檬苦素、諾米林、BSext對HTLV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性均有抑制作用，其中BSext對酶的抑制最強，為檸檬苦素和諾米林的13和1.2倍。

3.2.4 增強細胞免疫應答

細胞因子是由免疫細胞或某些非免疫細胞經(jīng)刺激誘導產(chǎn)生一類高活性小分子，如白細胞介素(interleukin，IL)和干擾素(inferferons，IFN)等，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。Petrera等[31]學者使用生物測定法和酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞因子的產(chǎn)生來評價免疫調(diào)節(jié)作用，研究表明CDM單獨或與2型單純皰疹病毒(HSV-2)組合使用時能增加TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10等細胞因子的水平。Mx1蛋白作為重要的抗病毒因子，其基因表達受IFN-I型和III型誘導，通過干擾核糖核酸蛋白復合物組裝，并降低病毒聚合酶活性來抑制流感病毒[48]，有研究表明，經(jīng)EMF處理的犬腎細胞，抗病毒蛋白Mx1明顯上調(diào)，這可能在抑制流感病毒感染中發(fā)揮一定作用。

4 檸檬苦素類物質(zhì)吸收代謝途徑

臨床前藥代動力學結(jié)果表明檸檬苦素在動物和人體內(nèi)的血藥濃度較低，生物利用度較差[49,50]。因此研究檸檬苦素類化合物的代謝過程對闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制發(fā)揮著重要作用。目前，對檸檬苦素類化合物代謝的研究方法主要包括肝微粒體體外代謝法、實驗動物原位腸灌流法及體外細胞實驗代謝產(chǎn)物分析法等。

研究表明，檸檬苦素在整個腸道內(nèi)均有吸收，但吸收途徑不是簡單的擴散吸收而是促進擴散[51,52]，其吸收主要受P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和細胞色素P450肝酶3A4(CYP3A4)的調(diào)節(jié)[53,54]。Zhang等[51]采用大鼠小腸原位灌流法研究檸檬苦素在十二指腸、結(jié)腸、回腸和盲腸的吸收情況，結(jié)果表明吸收速率常數(shù)Ka和P值沒有顯著性差異。Han等[53]通過進一步實驗證明說明檸檬苦素的吸收與MRP調(diào)節(jié)的藥物轉(zhuǎn)運無關(guān)，在P-gp和CYP3A4的調(diào)節(jié)下維拉帕米和酮康唑能夠以劑量依賴的方式顯著提高檸檬苦素的吸收，而丙磺舒對檸檬苦素吸收的改善效果不明顯，P-糖蛋白的主動外排和細胞色素P450肝酶3A4的首過效應可能是導致其生物利用度低的主要原因之一。

藥代動力學研究表明，檸檬苦素類化合物在體內(nèi)主要發(fā)生Ⅰ相代謝,包括羥基化及氫化[55]，最終經(jīng)尿液或糞便以原形及代謝產(chǎn)物的形式排出體外[55,56]。Ren等[54]使用超高效液相色譜與高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測人肝微粒體(human liver microsomes，HLMs)中四種檸檬苦素的代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明，在C-7和C-16處的還原、羥基化與還原檸檬苦素類物質(zhì)的糖基化反應是HLMs中檸檬苦素的主要代謝途徑。

5 結(jié)語

檸檬苦素類化合物是蕓香科和楝科植物的次生代謝產(chǎn)物，來源豐富，作為一種新型天然抗病原體活性物質(zhì)，其在抗動物源性細菌、動物病毒、植物病原菌方面具有廣泛的應用前景。近年來國內(nèi)外研究人員對檸檬苦素類化合物進行了大量研究，對其生物活性做了初步的闡明，但對于檸檬苦素類化合物的分子結(jié)構(gòu)、不同功能基團與其抗病原體活性之間的聯(lián)系仍處于初步探索階段，如檸檬苦素類化合物在動植物體內(nèi)存在多種抗病原體的作用機制，但是這些不同的途徑相互滲透、相互影響，需要對其復雜的抗病原菌機制進行更為深入地研究。此外，對于檸檬苦素類化合物經(jīng)口服在體內(nèi)吸收率低這一問題，其藥物制備方法可以結(jié)合納米微球、納米脂質(zhì)體、冰片、載藥微囊等技術(shù)展開進一步研究和技術(shù)更新，以期提高藥物的吸收率。鑒于目前一些研究對植物提取物及其抗毒素功效存在多樣的解釋，迫切需要對這些藥物進行進一步的評價，可通過使用適當?shù)母腥灸Ｐ瓦M行廣泛的體外、臨床前和臨床實驗，系統(tǒng)研究這些藥物發(fā)揮作用的機理，為進一步應用奠定理論基礎(chǔ)。