基于Nrf2/HO-1通路研究芹菜素改善妊娠期糖尿病大鼠氧化應(yīng)激損傷

楊麗 趙崗 樊秀梅 吳玲玲 田淑卿

[摘要] 目的 基于Nrf2/HO-1通路探討芹菜素對妊娠期糖尿病大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響。 方法 選用高脂喂養(yǎng)的36只妊娠SD大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素方法建立妊娠期糖尿病大鼠模型，按照隨機數(shù)字表法將其分為模型組、芹菜素組（50 mg/kg）、ML385組（Nrf2/HO-1通路抑制劑，劑量為20 mg/kg）、芹菜素+ML385組（芹菜素劑量為50 mg/kg，ML385劑量為20 mg/kg），每組9只。另取9只設(shè)為對照組。分組處理后，測量各組大鼠空腹血清血糖（FSG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）水平、肝組織病理變化;檢測大鼠血清中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平和Nrf2/HO-1通路蛋白表達。 結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠肝組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，伴有炎癥細胞浸潤，肝細胞變性、壞死，胞質(zhì)固縮、深染等病理損傷，F(xiàn)SG、TG、TC、血清中TNF-α及IL-6水平、肝組織MDA水平顯著升高（P < 0.05），肝組織SOD水平、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低（P < 0.05）;與模型組比較，ML385組大鼠肝組織病理損傷加重，F(xiàn)SG、TG、TC、血清中TNF-α及IL-6水平、肝組織MDA水平升高（P < 0.05），肝組織SOD水平、Nrf2、HO-1蛋白表達降低（P < 0.05）;與模型組比較，芹菜素組大鼠肝組織病理損傷減輕，F(xiàn)SG、TG、TC、血清中TNF-α及IL-6水平、肝組織MDA水平降低（P < 0.05），肝組織SOD水平、Nrf2、HO-1蛋白表達升高（P < 0.05）;與ML385組比較，芹菜素+ML385組大鼠肝組織病理損傷減輕，F(xiàn)SG、TG、TC、血清中TNF-α及IL-6水平、肝組織MDA水平降低（P < 0.05），肝組織SOD水平、Nrf2、HO-1蛋白表達升高（P < 0.05）。 結(jié)論 芹菜素可通過激活Nrf2/HO-1通路改善妊娠期糖尿病大鼠氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞] Nrf2/HO-1;芹菜素;妊娠期糖尿病;氧化應(yīng)激損傷

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0027-05

Study on apigenin improvement of oxidative stress injury in diabetic rats based on Nrf2/HO-1 pathway

YANG Li1? ?ZHAO Gang2? ?FAN Xiumei2? ?WU Lingling3? ?TIAN Shuqing1

1.Department of Obstetrics， Xingtai Maternal and Child Health Hospital， Hebei Province， Xingtai? ?054000， China; 2.Department of Obstetrics， Xingtai Third Hospital， Hebei Province， Xingtai? ?054000， China; 3.Department of Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College， Hebei Province， Xingtai? ?054000， China

[Abstract] Objective To study the effect of apigenin on oxidative stress injury in gestational diabetic rats based on Nrf2/HO-1 pathway. Methods Thirty-six pregnant SD rats of high-fat feeding were selected， the gestational diabetes rat model was established by intraperitoneal injection of chain urea with cephalosporins method， according to the random number table method they were divided into model group， apigenin group （50 mg/kg）， ML385 group （Nrf2/HO-1 pathway inhibitor， dose of 20 mg/kg）， apigenin + ML385 group （apigenin dose of 50 mg/kg， ML385 dose of 20 mg/kg）， with 9 mice in each group. Another 9 mice were set as the control group. After grouping， the levels of fasting serum blood glucose （FSG）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and pathological changes of liver tissue were measured; the serum levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were measured， and the levels of superoxide dismutase （SOD）， malonic dialdehyde （MDA） and Nrf2/HO-1 pathway protein expression of rats in each group were detected. Results Compared with the control group， the liver tissue of the model group showed structural disorder， accompanied by inflammatory cell infiltration， hepatocyte degeneration， necrosis， cytoplasm contraction， deep staining and other pathological damage， the levels of FSG， TG， TC， serum TNF-α and IL-6， and MDA in liver tissue increased significantly （P < 0.05）， and SOD level， Nrf2， HO-1 protein expressions in liver tissue were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of liver tissue in ML385 group was aggravated， the levels of FSG， TG， TC， serum TNF-α and IL-6， and MDA in liver tissue increased significantly （P < 0.05）， and SOD level， Nrf2， HO-1 protein expressions in liver tissue were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of liver tissue in the apigenin group was alleviated， the levels of FSG， TG， TC， serum TNF-α and IL-6， and MDA in liver tissue decreased significantly （P < 0.05）， and SOD level， Nrf2 and HO-1 protein expressions in liver tissue were significantly increased （P < 0.05）. Compared with ML385 group， the pathological damage of liver tissue in apigenin+ML385 group was alleviated， the levels of FSG， TG， TC， serum TNF-α and IL-6， and MDA in liver tissue decreased significantly （P < 0.05）， and SOD level， Nrf2 and HO-1 protein expressions in liver tissue were significantly increased （P < 0.05）. Conclusion Apigenin can improve oxidative stress injury in gestational diabetic rats by activating Nrf2/HO-1 pathway.

[Key words] Nrf2/HO-1; Apigenin; Gestational diabetes mellitus; Oxidative stress injury

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期首次被發(fā)現(xiàn)的糖代謝異?，F(xiàn)象，發(fā)病率較高，在中國約為7.0%，可造成高危妊娠，大大提高了早產(chǎn)、流產(chǎn)等的發(fā)生率，并可增加子代患肥胖、糖尿病及心血管疾病的風(fēng)險，嚴重影響母嬰健康[1-2]。GDM發(fā)病機制復(fù)雜，其中抗氧化能力下降導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是其主要因素[3]。芹菜素是多種水果和蔬菜的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，可用于治療糖尿病，并改善糖尿病引發(fā)的擴張型心肌病及肝損傷[4-5]。Nrf2/HO-1是機體內(nèi)源性保護體系之一，當(dāng)機體受到氧化應(yīng)激等刺激時，Nrf2激活并上調(diào)下游HO-1的表達，進而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，在糖尿病氧化應(yīng)激損傷病理過程中發(fā)揮著重要作用，上調(diào)Nrf2/HO-1通路，可抑制氧化應(yīng)激，減輕糖尿病引發(fā)的腎臟炎癥損傷[6-7]，而芹菜素可通過上調(diào)Nrf2、HO-1基因表達、轉(zhuǎn)錄而抑制叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，保護大鼠原代肝細胞[8]，因此推測芹菜素可通過上調(diào)Nrf2/HO-1通路改善GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷，本研究通過建立GDM大鼠模型，對此進行探討。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

55只雌性SD大鼠（浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），SPF級，6周齡，體重200～240 g，許可證號為SCXK（浙）2019-0001;邢臺醫(yī)專第二附屬醫(yī)院動物房中飼養(yǎng)，維持其環(huán)境安靜清潔、通風(fēng)良好，溫度約為25℃，相對濕度約為50%，大鼠自由進食、飲水，定時清洗、消毒鼠籠。

1.2 主要儀器與試劑

普通飼料及高脂飼料均購自上海普路騰生物科技有限公司，高脂飼料配方：普通繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預(yù)混料2.1%、麥芽糊精2.2%。芹菜素（中國藥品生物制品鑒定所，含量：99.6%，批號：111901-201206）;鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，貨號：S0130）;ML385（美國medchemexpress公司，貨號：HY-100523）;超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司，貨號：IC-SOD-Ra）;丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：xy-30182）;大鼠白細胞介素（IL）-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒、兔源GAPDH、Nrf2及HO-1一抗、羊抗兔二抗（美國Abcam公司，貨號分別為：ab100772、ab100785、ab181602、ab137550、ab13243、ab150077）;RIPA裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒（上海碧云天公司，貨號分別為：P0013K、P0011、C0105）。

全自動生化分析儀：美國BECKMAN公司;RM2035輪轉(zhuǎn)切片機：德國Leica公司;SMZ745光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司，上海欣軟信息科技有限公司;Elx800酶標(biāo)儀：美國Perkin Elmer公司;1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜儀：美國Bio-Rad公司;2500凝膠成像系統(tǒng)：上海天能公司。

1.3 實驗分組及處理

參照文獻[9]制備妊娠期糖尿病大鼠模型：以高脂飼料喂養(yǎng)雌性SD大鼠8周后，檢測空腹血清血糖（fasting serum glucose，F(xiàn)SG），將FSG≥6.67 mmol/L大鼠剔除。雌雄大鼠合籠，次日清晨陰道涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者為妊娠大鼠，以25 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素1次，72 h后檢測FSG，6.67 mmol/L≤FSG≤16.67 mmol/L的大鼠為造模成功的大鼠。共造模42只，成功36只，采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組、芹菜素組、ML385組、芹菜素+ML385組，每組9只。另取9只正常飼料喂養(yǎng)的妊娠母鼠作為對照組，腹腔注射25 mg/kg生理鹽水，最終用于實驗的大鼠共45只。

芹菜素和ML385分別以生理鹽水配制終濃度為5 mg/mL芹菜素溶液[10]、2 mg/mL ML385溶液[11]、芹菜素+ML385（濃度分別為5、2 mg/mL）混合溶液，芹菜素組、ML385組、芹菜素+ML385組大鼠每天以10 mL/kg劑量灌胃，模型組與對照組以等劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)14 d。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 血糖、血脂測定及標(biāo)本采集? 用藥結(jié)束24 h時，麻醉后處死大鼠，腹主動脈取血約4 mL。其中約3 mL血液全自動生化分析儀測定大鼠FSG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）含量;剩余血液離心后收集上清液即為血清，-80℃?zhèn)溆么?。解剖后取出肝臟，剪取1 g組織加入蛋白裂解液，使用勻漿機制備為勻漿液，離心后收集上清液儲存于-80℃?zhèn)溆?其余組織經(jīng)生理鹽水漂洗后，4%多聚甲醛固定、低濃度到高濃度的梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，然后使用切片機做病理切片備用。

1.4.2 大鼠肝組織病理變化情況檢測? 選取“1.2.2”中完好切片經(jīng)脫蠟、高濃度到低濃度梯度酒精處理后，參照蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒說明書進行染色，再次脫水、透明后封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理改變情況。

1.4.3 肝組織中SOD、MDA水平及血清TNF-α、IL-6水平測定? “1.2.2”項下蛋白裂解上清液、血清置于4℃冰箱中凍融，各取0.5 mL，參照說明書使用SOD、MDA檢測試劑盒及TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒分別測定其中MDA、SOD水平及TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 肝組織中Nrf2、HO-1蛋白水平檢測? 參照說明書使用BCA試劑盒測定“1.2.4”項下凍融的各組蛋白裂解上清液中總蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整各組蛋白樣品濃度至相同，取相同體積的各組蛋白樣品進行電泳分離蛋白，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子量截取相應(yīng)蛋白條帶置于小盒中，加入兔源Nrf2、HO-1一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗后加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液清洗后采用ECL顯色，置于凝膠成像儀中拍照，并采用Quantity One軟件分析各組蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠糖脂代謝情況比較

與對照組比較，模型組大鼠FSG、TG、TC水平顯著升高（P < 0.05）。與模型組比較，ML385組大鼠FSG、TG、TC水平升高，芹菜素組大鼠FSG、TG、TC水平降低（P < 0.05）。與芹菜素組比較，芹菜素+ML385組大鼠FSG、TG、TC水平升高（P < 0.05）。與ML385組比較，芹菜素+ML385組大鼠FSG、TG、TC水平降低（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠肝組織病理變化比較

對照組大鼠肝組織排列緊密，結(jié)構(gòu)正常，肝細胞胞質(zhì)豐富，無病理改變;模型組大鼠肝組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，伴有炎癥細胞浸潤，肝細胞變性、壞死，胞質(zhì)固縮、深染等病理損傷;ML385組大鼠上述病理損傷加重;芹菜素組大鼠上述病理損傷減輕;芹菜素+ML385組大鼠上述病理損傷重于芹菜素組，輕于ML385組。見圖1。

2.3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

與對照組比較，模型組大鼠肝組織MDA水平顯著升高（P < 0.05），SOD水平顯著降低（P < 0.05）。與模型組比較，ML385組大鼠肝組織MDA水平升高，SOD水平降低（P < 0.05）;芹菜素組大鼠肝組織MDA水平降低，SOD水平升高（P < 0.05）。與芹菜素組比較，芹菜素+ML385組大鼠肝組織MDA水平升高，SOD水平降低（P < 0.05）。與ML385組比較，芹菜素+ML385組大鼠肝組織MDA水平降低，SOD水平升高（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高（P < 0.05）。與模型組比較，ML385組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平升高，芹菜素組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低（P < 0.05）。與芹菜素組比較，芹菜素+ML385組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平升高（P < 0.05）。與ML385組比較，芹菜素+ML385組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低（P < 0.05）。見表3。

表3? ?各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較（x±s，n = 9）

注：與對照組比較，aP < 0.05;與模型組比較，bP < 0.05;與芹菜素組比較，cP < 0.05;與ML385組比較，dP < 0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α;IL-6：白細胞介素-6

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低（P < 0.05）。與模型組比較，ML385組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低，芹菜素組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達升高（P < 0.05）。與芹菜素組比較，芹菜素+ML385組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達降低（P < 0.05）。與ML385組比較，芹菜素+ML385組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達升高（P < 0.05），見圖2、表4。

3 討論

GDM是孕婦圍生期常發(fā)疾病之一，嚴重影響母體及子代健康，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，目前臨床治療GMD以口服降糖藥及注射胰島素為主，但長期服藥或注射胰島素對母體健康及胎兒發(fā)育有一定危害，尋找更安全有效的治療手段是臨床亟需解決的問題[12]。GMD患者機體抗氧化能力下降，引發(fā)體內(nèi)氧自由基過剩，造成細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，肝臟作為機體調(diào)控糖脂代謝最重要的器官，對氧化應(yīng)激反應(yīng)很敏感。因此，妊娠期糖尿病患者極易出現(xiàn)肝損傷，影響肝功能，最終造成血糖、血脂升高[13-14]。SOD和MDA為檢測氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)，TNF-α、IL-6可引發(fā)炎性反應(yīng)并促使其進展[15-16]，經(jīng)鏈脲佐菌素處理的孕鼠血清TNF-α及IL-6水平、肝組織MDA水平顯著升高，肝組織SOD水平顯著降低，提示鏈脲佐菌素引發(fā)大鼠炎癥，造成肝臟氧化應(yīng)激損傷，模型建立成功。

芹菜素能夠增強鏈脲佐菌素所致糖尿病大鼠的抗氧化能力，降低血脂，減輕氧化應(yīng)激造成的心肌損傷[17]。Nrf2/HO-1在糖尿病腎病、糖尿病大鼠腦缺血損傷病理過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，激活時可清除體內(nèi)自由基，減輕炎癥及氧化應(yīng)激損傷[18-19]，芹菜素可促進Nrf2、HO-1蛋白表達，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，對衰老小鼠發(fā)揮保護作用[20]，因而推測芹菜素可能通過激活Nrf2/HO-1信號增強機體抗氧化能力，進而改善GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷。以芹菜素處理模型大鼠后，可減輕大鼠肝組織病理損傷，降低血清FSG、TG、TC、TNF-α、IL-6水平及肝組織MDA水平，升高肝組織SOD水平、Nrf2及HO-1蛋白表達，提示芹菜素可上調(diào)Nrf2/HO-1信號表達，緩解氧化應(yīng)激及炎癥損傷，降低血糖、血脂水平。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Nrf2/HO-1通路表達可減輕芹菜素對GMD大鼠的抗氧化應(yīng)激作用，抑制其降低GDM大鼠血糖、血脂的作用，提示芹菜素是通過激活Nrf2/HO-1信號增強機體抗氧化作用，進而改善GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，芹菜素可增強GDM大鼠抗氧化能力，抑制炎性反應(yīng)，減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷，降低其血糖、血脂水平，激活Nrf2/HO-1信號通路是其藥理機制之一，為臨床GDM的治療提供新的參考，但芹菜素對Nrf2/HO-1信號下游的影響本文未涉及，因而其改善GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷的更全面確切的作用機制并未完全闡明，還需后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2019-12-03? 本文編輯：劉永巧）