一株肉雞源大腸桿菌的分離鑒定與致病性分析

丁樹榮

摘 ?要：為了解規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場致病性大腸桿菌的耐藥性與致病性，并為規(guī)?；B(yǎng)殖場提供大腸桿菌病的防治參考。從山西省某規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場采集病死雞病料，進行大腸桿菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗、致病性試驗。結果表明：分離到1株血清型為O2的致病性大腸桿菌，分離菌對頭孢類、喹諾酮類等8種藥物耐藥，對妥布霉素、阿米卡星高敏，對強力霉素、氧氟沙星中敏。結論：分離株肉雞源大腸桿菌具有多重耐藥性和較強的致病性，季節(jié)交替要加強雞場飼養(yǎng)管理。

關鍵詞：肉雞;大腸桿菌;分離鑒定;藥敏試驗;致病性分析

中圖分類號：S858.314.4+3 ? ?文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2020）5-0045-04

2019年5月山西省晉中市某肉雞養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的30000只33日齡科寶肉雞出現(xiàn)雞只死亡增多的現(xiàn)象，病死雞剖檢可見氣囊渾濁，心包積液，腹腔內(nèi)有纖維素樣滲出物，腸粘膜充血，偶見出血，盲腸扁桃體出血。初步診斷為大腸桿菌感染，無菌采取病死雞的肝組織、肺組織樣品，冰盒保存，送實驗室12h內(nèi)進行細菌的分離培養(yǎng)鑒定。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料 ?檢測樣品，為某肉雞養(yǎng)殖場送檢的病死雞;試驗用培養(yǎng)基，購自青島賓得生物技術有限公司，實驗室現(xiàn)配現(xiàn)用;細菌微量生化反應管和藥敏試紙，購自杭州濱和微生物試劑有限公司;PCR試劑，購自北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司;大腸桿菌“O”抗原單價血清，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)。試驗動物，1日齡商品代雛雞20只，山西省太原市北格種雞場饋贈。

1.2 ?細菌分離培養(yǎng) ?稱取0.1g的病死雞肺組織樣品，生理鹽水梯度稀釋，接種于麥康凱培養(yǎng)基，溫箱37℃培養(yǎng)過夜。挑選粉紅色單菌落，再次接種于伊紅美藍瓊脂，37℃過夜培養(yǎng)。挑選有金屬光澤的菌落接種于肉湯，振蕩培養(yǎng)后溫箱過夜，染色鏡檢。

1.3 ?生化鑒定 ?按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[1]，將肉湯培養(yǎng)基中的菌液，分別滴入生化反應管鑒定。

1.4 ?PCR鑒定 ?根據(jù)大腸桿菌16S rDNA的保守基因片段，設計引物，引物序列與反應體系參照文獻方法進行[2]。

1.5 ?血清型鑒定 ?采用大腸桿菌單因子標準陽性血清，與分離菌株的菌體抗原進行玻璃板凝集反應。

1.6 ?藥物敏感性試驗 ?采用K-B紙片擴散法進行藥物的敏感性試驗，參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLC）標準進行操作與判斷。

1.7 ?致病性試驗 ?采用腹腔注射法，將調(diào)到3×108CFU/mL的菌液，注射7日齡雛雞0.5mL/只，設不注射和注射生理鹽水的對照組兩個，每組6只雛雞。觀察雛雞死亡情況，并取死亡雞只病變組織，分離菌株與原菌液菌進行比較。

2 ?結果

2.1 ?細菌的分離培養(yǎng) ?細菌的分離培養(yǎng)結果見圖1。

樣品液在麥康凱平板長出光滑、紅色的菌落，（圖1A），在伊紅美藍瓊脂上長出了帶有金屬光澤的菌落，劃線分離出一株菌株，命名為JZE01。將JZE01在營養(yǎng)肉湯里培養(yǎng)后出現(xiàn)渾濁，革蘭氏染色鏡檢為紅色的兩端鈍圓的長桿菌（圖1B），符合大腸桿菌形態(tài)。

2.2 ?生化鑒定 ?JZE01菌株生化反應鑒定結果見表1。

由表1可知，該菌可以發(fā)酵糖，吲哚試驗、甲基紅試驗陽性，不產(chǎn)生H2S，初步鑒定JZE01為大腸桿菌。

2.3 ?PCR鑒定 ?將JZE01菌株菌液進行16S rDNA基因擴增得到與預期基本一致的片段，約1450bp?；厥諟y序，進行BLAST比對，與大腸桿菌同源性為99.92%。

2.4 ?血清型鑒定 ?利用“O”抗原標準血清進行鑒定，JZE01菌定型為O2。

2.5 ?藥敏試驗 ?選取常見的抗菌藥物12種，對菌株JZE01進行藥物敏感性試驗，試驗結果顯示JZE01株對頭孢類、喹諾酮類等8種藥物耐藥，對妥布霉素、阿米卡星高敏，對強力霉素、氧氟沙星中敏，表明分離株JZE01對多種藥物具有耐藥性。藥敏試驗結果見表2。

2.6 ?致病性試驗 ?腹腔注射菌苗后的雛雞，6h后出現(xiàn)精神不振、怕冷扎堆、食欲降低甚至廢絕，很少飲水，并出現(xiàn)白色稀糞，在21、33、69h檢查各死亡2只，剖檢病死雞發(fā)現(xiàn)氣囊渾濁增厚，心包有積液，包膜增厚，有纖維素性滲出物，腸道出血，有粘性滲出物。對照組生長正常，未出現(xiàn)任何癥狀。回收死亡雞組織，分離到與原接種菌一致的菌株。

3 ?討論

大腸桿菌是一種條件性致病菌，在規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場的雞舍中，從舍內(nèi)環(huán)境、裸露飼料、飲水和糞便等來源中均可以分離到該菌，它的血清型復雜，其中的致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia coli， APEC）給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的危害，特別是當肉雞群發(fā)生病毒性疾病或者支原體病時，可以造成肉雞死淘率增加[2-4]。據(jù)調(diào)查規(guī)?；子鹑怆u養(yǎng)殖場發(fā)生大腸桿菌病的主要原因：一是環(huán)境因素突變引起的雞群應激，當外界氣溫驟升驟降或者刮起大風，雞舍沒有及時調(diào)節(jié)通風小窗的大小，造成局部溫度高于或者低于設定溫度，時間長久導致雞群抵抗力下降，誘發(fā)大腸桿菌病;二是雞場發(fā)生其它疫病的時候，比如發(fā)生支原體病或者新城疫時，雞群免疫功能降低，發(fā)生與大腸桿菌病的混合感染或者繼發(fā)感染;三是飼料和飲水中含有大腸桿菌，規(guī)模化的雞場應該定期對飼料和飲水進行大腸桿菌指標檢測，一旦發(fā)現(xiàn)指數(shù)超標，就要停止使用，在清除原因后再進行飼喂或者飲水;四是糞便中的大腸桿菌引起，雞的糞便中含有致病性大腸桿菌，可以通過其它途徑感染雞群，這與糞便清理的速度密切相關，要求雞舍每日清理糞便，特別是在炎熱的夏季。