反相高效液相色譜法測定神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸含量

吳樂艷，侯雯清，孫孔春，楊璨瑜，舒 紋，沈報春

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500）

神經(jīng)酸（Nervonic acid） 因最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的神經(jīng)組織中而得名，其在周圍神經(jīng)組織和腦組織中含量較高，是神經(jīng)組織中生物膜的重要組成成分，也是大腦發(fā)育及維持正常功能所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，對神經(jīng)介質(zhì)和受體發(fā)揮作用具有重要的意義[1]。有研究表明，神經(jīng)酸具有增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫[2]、改善記憶、認(rèn)知功能損傷保護(hù)和抗氧化[3]作用，能疏通受損大腦神經(jīng)通路并可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生[4]。此外，神經(jīng)酸對帕金森病[5-6]、腦白質(zhì)疏松癥[7-8]、Zellweger 綜合征[9]、多發(fā)性硬化癥[10]、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[11]、腦血管疾病[12-13]等有一定的治療和預(yù)防作用。神經(jīng)酸被認(rèn)為是21 世紀(jì)最有前途的腦健康保健品和藥品，為預(yù)防和治療腦部疾病提供了一條新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。

目前，神經(jīng)酸定量分析多采用衍生化氣相色譜法[15-18]，該方法是將神經(jīng)酸酯化后測定酯化物的含量，前處理過程較繁瑣，且可能存在未反應(yīng)的神經(jīng)酸，導(dǎo)致神經(jīng)酸含量測定不準(zhǔn)確。文獻(xiàn)[19]采用了高效液相色譜法測定蒜頭果油分離出的神經(jīng)酸含量，本文將建立一種反相高效液相色譜方法直接測定神經(jīng)酸的含量，該方法不需對樣品進(jìn)行酯化，可直接進(jìn)樣分析，流動相組成簡單，分析時間短，定量準(zhǔn)確，可在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀（包含島津SPD-M10A 檢測器，島津LC solution 色譜工作站）；超純水機(jī)（Direct-Q 3 UV）：美國Millipore 公司；電子天平（BS224S）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲清洗儀（SK3200H）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品：由云南盈木佳生物科技有限公司提供（純度99.0%）；神經(jīng)酸片劑：某公司生產(chǎn)；乙腈（色譜純）：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸（分析純）。?shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25℃）。

1.2 色譜分析條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 4 g，以乙腈為溶劑，配制濃度約為2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 至10 mL 容量瓶中，加入9 mL 乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；再按照濃度梯度稀釋法分別配制濃度為0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL 的多份標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 待測樣品溶液配制

取神經(jīng)酸片劑10 片，精密稱定，研細(xì)。精密稱取適量，置10 mL 容量瓶中，加乙腈適量，超聲處理使主成分溶解，乙腈定容至刻度，充分搖勻，得待測樣品溶液，備用。

1.5 測定

將標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品溶液先用0.22 μm 的有機(jī)系濾膜過濾，取續(xù)濾液以10 μL 的進(jìn)樣量上樣于高效液相色譜儀，記錄保留時間、峰面積等參數(shù)。按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計算，即可測得神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取神經(jīng)酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以各份標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（X，mg/mL） 為橫坐標(biāo)，以神經(jīng)酸色譜峰的峰面積（Y） 為縱坐標(biāo)作圖（見圖1），得線性回歸方程y＝3 000 000 X（mg/mL）+4 795.9，R2＝0.999 9。神經(jīng)酸含量在0 .01～0.2 mg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（P=0.000）。

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取2 mg/mL 神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL，照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果見表1。峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.80%，說明實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取待測樣品溶液10 μL，照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，在24 h 內(nèi)測定6次（0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h），記錄峰面積，結(jié)果見表1。由表1可見，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.52%，待測樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 加樣回收率照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，首先測定待測樣品溶液中神經(jīng)酸的峰面積，帶入“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測樣品溶液的濃度。接著將待測樣品溶液平均分成9 份，再分成3 組，每組分別添加相當(dāng)于待測樣品溶液中神經(jīng)酸含量80%、100%、120%三個水平的神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見表2。由表2 可見，添加神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后所得樣品的回收率在96.94%～104.46%之間，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在0.81%～3.80%之間，平均回收率為101.53%。該方法準(zhǔn)確度良好，可用于神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸的定量分析。

2.2 樣品含量測定

圖1 神經(jīng)酸線性回歸方程Fig.1 Linear regression equation of nervonic acid

表1 精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）Tab.1 Precision and stability results （1）

表1 精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2）Tab.1 Precision and stability results （2）

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Spiked recoveries and RSDs results

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品典型色譜圖Fig.2 Representative chromatograms of standard and sample

按照“1.2.3”項(xiàng)下方法，分別精密稱取約相當(dāng)于神經(jīng)酸10 mg 的片粉，制備兩份神經(jīng)酸樣品溶液，采用建立的高效液相色譜方法測定兩份樣品溶液中神經(jīng)酸的含量，典型色譜圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Tab.3 Analytical results for the sample

3 討論

神經(jīng)酸不僅可以修復(fù)受損的神經(jīng)纖維，而且還可促進(jìn)受損的神經(jīng)細(xì)胞再生，對動脈粥樣硬化、高血脂、腦梗塞、腦出血、腦萎縮、癡呆、小兒腦癱、癲癇、帕金森病、腦外傷等疾病的防治有一定作用。國外對神經(jīng)酸的研究已開展了將近一個世紀(jì)，但在我國尚處于起步階段，對于其來源、獲取方法、藥理作用、生理作用及新劑型、應(yīng)用等的研究還有很大空間。

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中曾采用現(xiàn)有報道的衍生化氣相色譜法測定神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸含量，先將樣品進(jìn)行脂肪酸甲酯化，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，氣相色譜法測定，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)由于神經(jīng)酸沸點(diǎn)較高，采用將神經(jīng)酸進(jìn)行甲酯化后再定量的方法，可能存在神經(jīng)酸甲酯化不完全的問題；甲酯化后又經(jīng)過正己烷提取的操作，整個含量測定過程前處理操作步驟較多，會存在神經(jīng)酸損失導(dǎo)致測定值比真實(shí)值偏小、定量不準(zhǔn)確的問題，提取回收率較低；前處理過程復(fù)雜也存在方法的重復(fù)性及可操作性不強(qiáng)等缺陷?；诖?，筆者建立了一種直接測定樣品中神經(jīng)酸含量的反相高效液相色譜方法，提高了神經(jīng)酸定量的準(zhǔn)確度。

本研究建立的含量測定方法，首次采用C8柱，神經(jīng)酸出峰時間大概在20 min，具有分析時間短，分析效率高等優(yōu)點(diǎn)[20]，實(shí)現(xiàn)了對神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸含量的準(zhǔn)確測定，該方法不需要進(jìn)行衍生化，前處理過程簡單易操作，分析條件溫和，分析速度快，定量結(jié)果準(zhǔn)確。此外，該方法的色譜條件、流動相組成簡單，精密度、重復(fù)性及RSD符合相關(guān)規(guī)定，穩(wěn)定性好，靈敏度高，選擇性好?？蓪?shí)現(xiàn)人力、物力、財力的節(jié)省，有利于神經(jīng)酸資源的開發(fā)及運(yùn)用，具有較好的應(yīng)用前景。