噬菌體療法在口腔感染性疾病中的應用

向盈盈 ，宋 飛，楊向紅，周 靜，于鴻濱，魏云林，季秀玲

（1） 昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院口腔科，云南昆明 650031；2） 昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院微創(chuàng)介入科，云南昆明 650106）；3） 昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500）

抗生素長期、不規(guī)范的使用，造成臨床耐藥性問題日益嚴重，細菌感染和抗生素耐藥是全球公共衛(wèi)生和醫(yī)療保健的重大問題。2016年聯(lián)合國大會將抗生素耐藥性問題列為“最大和最緊迫的全球風險”。萬古霉素曾被認為是抵抗耐藥菌的最后一道防線，但隨著耐萬古霉素糞腸球菌的頻繁出現(xiàn)及其抗性在菌株間迅速傳播，嚴重危害人類健康，也給臨床治療耐藥菌感染帶來了難題。隨著新型抗生素的不斷開發(fā)和使用，新的耐藥菌也在不斷增加。目前，隨著“超級細菌”的出現(xiàn)，人類對感染疾病的控制越來越難，而噬菌體治療重新得到人們的重視。噬菌體能與細菌特異性結合，并且只感染原核細胞，不感染真核細胞[1-2]，是一類具有較大潛力的新一代生物抗菌劑。

2017年“上海噬菌體與耐藥研究所”在復旦大學附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心掛牌成立，從事噬菌體研究和臨床轉化，致力于提高我國對抗感染性疾病的醫(yī)療能力。2018年8月20 日，該臨床中心利用噬菌體成功治愈一例“超級細菌”—多耐藥肺炎克雷伯菌引起的尿路感染，這是繼1958年余賀教授利用噬菌體治療皮膚綠膿桿菌感染案例以來的全國第2例。2019年2月19 日，美國FDA 批準了靜脈注射噬菌體的臨床試驗，以挽救感染多重耐藥菌而生命垂危的病人。近期Cell Host Microbe 也刊發(fā)噬菌體治療的專題綜述報道。這預示著噬菌體治療將起死回生，對多種抗生素耐藥的“超級病菌”的死期可能快到了。

1 微生物與口腔感染性疾病

口腔微環(huán)境與外界環(huán)境密切相關，隨外界環(huán)境的改變發(fā)生重大改變。同時口腔內自身解剖結構及生長發(fā)育，同樣影響著口腔微生物的定植；口腔微生物豐度及多樣性的改變，會引起口腔多種疾病的發(fā)生。

1.1 齲病

齲病是口腔科最常見的細菌感染性疾病。目前的研究認為齲病的發(fā)生、發(fā)展是口腔中微生態(tài)的酸堿平衡被打破，多種細菌共同作用的結果。細菌的菌群失調是打破口腔酸堿平衡的重要原因，而變異鏈球菌（Streptococcus mutans） 是導致齲病的主要致病菌，但它不一定是主要的優(yōu)勢菌，乳酸菌和放線菌等與齲病的發(fā)生發(fā)展也有一定的關聯(lián)。韋榮球菌、棒狀桿菌、纖毛菌和丙酸菌以及阿托波菌等細菌同樣參與了齲病的形成[3]；Ling 等[4]學者認為鏈球菌屬、韋榮球菌屬、放線菌屬、顆粒鏈菌屬、纖毛菌屬和硫單胞菌屬等與齲病的發(fā)病密切相關。Jiang 等[5]分析齦上菌斑認為：緩癥鏈球菌、彎曲菌、二氧化碳噬纖維菌、伯克霍爾德菌和普雷沃菌在高齲的中國學齡前兒童檢出率極低。齲病的不同臨床階段，細菌的種類及數(shù)量仍有不同，Neves[6]證實雙歧桿菌和干酪乳桿菌在牙本質活躍性齲壞中含量較高，變異鏈球菌在靜止性齲損部位中含量相對較高。內氏放線菌、輕型鏈球菌和戈登鏈球菌在活躍性齲和靜止性齲損中含量無明顯改變。

1.2 牙周病

牙周病是指發(fā)生在牙支持組織（牙周組織）的疾病，包括僅累及牙齦組織的牙齦病和波及深層牙周組織（牙周膜、牙槽骨、牙骨質） 的牙周炎兩大類。牙周疾病是常見的口腔疾病[7]。細菌侵入牙周組織是牙周病發(fā)病的一個重要因素[8]。目前發(fā)現(xiàn)了超過400 種細菌存在于牙周炎發(fā)生部位，而菌斑已確認是牙周病發(fā)生、發(fā)展的始動因子。牙周病的發(fā)生、發(fā)展與菌斑內革蘭氏陰性厭氧菌密切相關，研究證實口腔內的放線共生放線桿菌、牙齦卟琳菌、福賽類桿菌、中間普氏菌、直型彎曲菌、纏繞優(yōu)桿菌、微小消化鏈球菌、鏈球菌中間復合體、齒垢密螺旋體、具核梭桿菌、產黑菌[9-10]、擬桿菌、隱藏真桿菌、牙髓卟啉單胞菌、棲牙普雷沃菌、微小消化鏈球菌、消化鏈球菌、齦溝產線菌、脫硫球莖菌、小桿菌、齦溝螺桿菌、脫鐵桿菌、擬桿菌AU126、Division TM7、Division I025、BRC1、OP10 和OP3 等[11]共同參與了牙周炎的形成。

1.3 牙髓及根尖周病

口腔牙髓及根尖周炎是發(fā)生于牙齒根尖周組織常見感染性疾病，如牙骨質、根尖周圍的牙周膜和牙槽骨等，牙髓及根尖周炎就診率高達牙體牙髓科門診的60%。根尖周炎是由于根管內及根尖周定植的微生物群落失調引起，是以厭氧菌為主的混合微生物感染所致[12]。不同個體、感染部位、感染時間的根尖周炎微生物群落組成和多樣性具有較大差異，近根尖端較近冠方的微生物有更高的細菌多樣性[13]。盡可能地去除根管內感染源是治療的根本，根管治療術是目前治療根管內感染的重要方法，也是首選的方法。通過根管預備、消毒和充填等步驟能有效清除根管內的感染源，阻止病變的發(fā)生發(fā)展，促進根尖周病灶的愈合。雖然臨床上根管治療成功率不斷提高，但患牙仍然存在4%～15%的失敗率。究其原因，除根充技術不足外，更加重要的原因是治療后殘留在根管系統(tǒng)中的細菌感染。難治性根尖周炎（Refractory Periapical Periodontitis，RPP） 是臨床中經多次規(guī)范根管治療也難于治愈的疾病，造成反復根尖周膿腫和進行性骨質破壞，嚴重影響患者的生存質量。在難治性根尖周區(qū)牙齦卟啉單胞菌、丙酸丙桿菌、微小微單胞菌、糞腸球菌、真菌都有較高的檢出率[14]。糞腸球菌（Enterococcus faecalis） 在初發(fā)感染的未治療的根管內數(shù)量很低，但在治療失敗的根管微生物檢測時發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌的檢出率最高，是最主要的病原菌[14-17]。Nair 等[18]在根管治療后根尖周持續(xù)性感染的患牙標本中發(fā)現(xiàn)糞腸球菌的檢出率高達77%，甚至成為根管治療后根管再次感染的唯一檢出細菌。根尖周炎經過根管預備、根管消毒和根管充填過程后，根管內的微環(huán)境再次改變，細菌豐度及種類發(fā)生重大改變，尤其是位于根尖損傷區(qū)的根尖段。Siqueira J F[19]研究發(fā)現(xiàn)：在炎癥持續(xù)存在的已充填根管內，乳酸菌（Lactic acid bacteria） 占比由5%以下升高到29～77%，根管內糞腸球菌（E.faecalis） 的占比也明顯增加[20]，這是因為根管充填后的缺氧環(huán)境抑制了葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、丙酸菌屬（Propionibacterium sp.）、普氏菌（Prevotella sp.）、放線菌屬（Actinomyces sp.）、鏈球菌（Streptococcus sp.） 和假單胞菌（Pseudomonas sp.） 等生長，從而造成根管及根尖周菌群失調，而糞腸球菌對惡劣環(huán)境的耐受性強，克服缺氧環(huán)境繼續(xù)生長繁殖。因此，控制糞腸球菌感染在根管治療中十分重要，徹底清除糞腸球菌感染是提高難治性根尖周炎治愈率的關鍵[21]。

2 噬菌體

噬菌體是一類以原核微生物為宿主的病毒，廣泛存在于自然環(huán)境中，種類復雜多樣，地球上約有1 030～1 032 個噬菌體，其數(shù)量相當于細菌的十幾倍甚至幾十倍[1]。幾乎每一個細菌都有其對應的噬菌體。噬菌體結構簡單，僅由衣殼蛋白和其內部的遺傳物質組成，缺乏獨立代謝能力，依靠宿主細胞的核糖體、蛋白質來合成自身生長和增殖所需的各種因子、各種氨基酸和能量。一旦離開宿主細胞，噬菌體既不能生長，也不能復制，進入靜止期。

目前噬菌體分類有以下幾種方式：根據(jù)其遺傳物質的不同，可將其分為ss DNA、ds DNA、ss RNA 和ds RNA 噬菌體；根據(jù)形態(tài)大小，可將其分為長尾噬菌體科（Siphoviridae）、肌尾噬菌體科（Myoviridas） 和短尾噬菌體科（Podoviridae） 等；根據(jù)形狀，可將其分為蝌蚪狀、絲桿狀、球狀等；根據(jù)對宿主菌的寄生方式，可將其分為裂解性噬菌體、溶原性噬菌體。裂解性噬菌體亦稱毒性噬菌體，其生活周期主要包括吸附、侵入、增殖、裝配、裂解五階段。噬菌體在感染寄主細菌后，啟動自身早期基因的表達，抑制宿主細菌DNA 合成，合成自身核酸；以自身核酸作為模板，產生大量的結構蛋白，裝配產生下一代噬菌體顆粒。溶解酶編碼基因表達大量穿孔素（Holin），裂解細胞壁，釋放子代噬菌體，再次進入下一個感染周期。溶原性噬菌體（Lysogenic phage） 亦稱溫和噬菌體，進入宿主細菌內并不產生裂解作用，而將其基因組整合到宿主染色體中，和宿主核酸同步復制，并隨著細菌的繁殖傳給下一代，宿主細胞不裂解而繼續(xù)生長。

噬菌體在腸道菌群中扮演非常重要的角色，健康人群中腸道內大約含有1 015 個噬菌體，是自然界中生物體含量最密集的生態(tài)生境之一[22]。Qin等[23]通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，124 個糞便標本中約有5%是編碼噬菌體的相關蛋白。噬菌體在維持腸腔中菌群之間數(shù)量上的平衡方面發(fā)揮非常重要的作用，并且可以向宿主菌傳遞新基因、調節(jié)菌群多樣性及產生新的特征[24-25]。噬菌體參與殺滅腸道病原菌，維持人體腸道內正常細菌豐度及種群數(shù)量。噬菌體還可以通過腸道粘膜上皮進入黏膜固有層，甚至血液系統(tǒng)，參與抗菌以及系統(tǒng)免疫反應。Gorski等[26]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體能抑制T 細胞和轉錄因子kB（Nuclear factor kappaB，NF-kB） 的激活，同時抑制體液免疫和細胞免疫。噬菌體在微生態(tài)協(xié)同進化中同樣發(fā)揮著非常重要的作用，微生態(tài)協(xié)同進化本質上就是微生物基因組的變化[27]，使宿主菌對環(huán)境的更加適應。當外界有害環(huán)境，特別是抗生素作用于宿主菌時，溫和型噬菌體和宿主菌互利共生，水平轉移基因，使宿主菌產生或獲得耐/抗性基因，提高宿主菌生存能力，也間接保障了噬菌體的生存。

3 噬菌體療法

目前，口腔疾病的治療方法就是在抗生素的輔助下，進行手術或者非手術清除致病菌，重新達到口腔微生態(tài)環(huán)境的平穩(wěn)?？谇晃⑸鷳B(tài)環(huán)境的失衡是導致疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。在口腔牙周炎及根尖周炎等感染性疾病中，抗生素的療效并不理想，預后不良，給患者帶來更多的痛苦及經濟費用。

噬菌體的應用由來已久[28-30]，具有較好的應用前景[31]。噬菌體已經在動物養(yǎng)殖、水產養(yǎng)殖、細菌分類檢測以及環(huán)境和食品等領域逐漸應用。從20世紀40年代起，波蘭、格魯吉亞和俄羅斯等西方國家一直致力于噬菌體的研究，把噬菌體用于預防和治療細菌感染，噬菌體療法孕育而生。與抗生素相比，噬菌體破壞生物膜的效率更高，噬菌體可以感染存在于生物膜上層的細菌并復制形成新的噬菌體，其可以穿透內層并感染剩余的細菌直至完全清除細菌[32]。

簡單來說，噬菌體療法就是通過噬菌體的宿主專一性來感染細菌，裂解細菌或降低細菌致病性達到治療人和動物細菌感染的作用[2，33]。關于噬菌體療法的安全問題一直存在爭論，有研究發(fā)現(xiàn)部分噬菌體可能含有外毒素[34]。然而，更多的實驗證實噬菌體療法是安全的。在動物中，噬菌體治療禽類傷寒以及巴斯德菌（Pasteurella） 所致牛出血性敗血癥均獲得的良好的療效[35]。Smith 等[36]用噬菌體治療小牛腹瀉取得良好的效果。Soothill 等[37]證明噬菌體對豚鼠燒傷后銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）感染有良好的療效。Cerveny 等[38]研究顯示，靜脈注射噬菌體可以治療弧菌（Vibrio） 引起的小鼠感染。在人體上進行的噬菌體安全性試驗也證明噬菌體療法非常有效，而且也是安全的。從1919年Felix d'Herelle[39]在法國首次將噬菌體用于治療嚴重痢疾的兒童以來，許多的臨床試驗取得成功，沒有發(fā)現(xiàn)任何有害的副作用[40-41]。將高濃度葡萄球菌噬菌體應用于人的鼻腔粘膜、口腔、皮下和靜脈，未見明顯副作用[42]。在瑞典，15 名健康成年志愿者在他們的飲用水中接受較低的大腸桿菌（Escherichia coli） 噬菌體T4 劑量、較高的噬菌體劑量和安慰劑，結果顯示服用大腸桿菌噬菌體的志愿者未發(fā)現(xiàn)安全問題[43]。

根據(jù)治療的方式不同，將噬菌體療法分為以下兩種。

3.1 傳統(tǒng)噬菌體療法

傳統(tǒng)噬菌體療法是指將天然分離的毒性噬菌體作為新的抗菌劑直接施用于患者，目的是裂解急性或慢性感染病灶中的致病菌。其優(yōu)勢是噬菌體容易分離得到，但缺點是細菌裂解后可能產生大量的炎性蛋白及爆發(fā)性炎癥反應，噬菌體宿主譜窄，細菌易產生噬菌體耐性等。Basu 等[44]在小鼠研究中證實，噬菌體療法能有效治療銅綠假單胞菌（P.aeruginosa） 引起的傷口燒傷感染，在高致病性肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）[45]、大腸桿菌[46]、多重耐藥克伯雷白桿菌（Klebsiella sp.[47]引起的動物肺部感染中，噬菌體治療也能夠有效減少致病微生物生物膜的形成，使肺損傷明顯改善，提高動物存活率。Shafiqul 等[48]采用噬菌體雞尾酒給健康及急性感染腹瀉的兒童口服，結果表明噬菌體并不引起急性感染患者的腸道菌群失調，初步證明了口服噬菌體是安全有效的。Singh等[49]利用噬菌體裂解蛋白治療小鼠金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 菌血癥，結果顯示療效較好，小鼠的存活率明顯提高。含有噬菌體裂解蛋白的噴劑或軟膏能夠明顯抑制皮膚金黃色葡萄球菌增殖。

噬菌體在口腔疾病治療方面也有報道，如Li等[50]采用噬菌體局部治療結核性口腔潰瘍，取得了良好效果；而Mario 等[51]從牙科廢水中提取伴放線放線桿菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）的噬菌體用于牙周炎的治療，Leron 等[52]則在體外利用糞腸球菌噬菌體EFDG1 治療根尖周炎，結果發(fā)現(xiàn)EFDG1 能夠很好的抑制糞腸球菌的生物膜形成，可以達到治療根尖周炎的目的。因此，噬菌體療法在消滅口腔病原體和清除細菌方面是有幫助的。

3.2 改造噬菌體療法

由于傳統(tǒng)噬菌體療法的有限性，目前國外研究多集中改造噬菌體療法。改造噬菌體療法是指通過改變噬菌種類、數(shù)量，分離特異性的噬菌體裂解酶，以及利用現(xiàn)代分子生物學手段和方法改造編碼一些功能蛋白的基因，以期解決傳統(tǒng)噬菌體療法中宿主譜窄、耐噬菌體等問題。該方法的優(yōu)點是機體不易產生過強免疫應答，提高了噬菌體的治療效果。遺憾的是，目前關于改良噬菌體法應用到口腔疾病治療尚未見報道。

目前，改造噬菌體療法取得了一些良好效果。Kim 等[53]通過運用化學方法將非免疫原性聚合物單甲氧基聚乙二醇（mPEG） 附著到噬菌體表面構建的聚乙二醇化噬菌體（PEGylation） 提高噬菌體在血漿中的半衰期。Mahichi 等[54]通過同源重組將廣譜噬菌體IP08 的長尾纖維基因gp37 和gp38 轉移給窄譜裂解性噬菌體T2，擴大T2 的宿主譜。Ando H 等[55]通過插入失活使金黃色葡萄球菌噬菌體P954內溶素基因喪失功能，編碼致死但非裂解性的蛋白，能殺死但不裂解細菌，可有效治療感染MRSA的免疫低下小鼠。Rotem 等[56]通過λ 噬菌體引入抗生素致敏基因rpsL 和gyrA，可使細菌抗生素敏感性提高2～8 倍。徐晶晶等[57]發(fā)現(xiàn)噬菌體裂解酶ClyR在體外實驗中對重度低齡兒童齲中的變異鏈球菌和遠緣鏈球菌（S.sobrinus） 均有較強的殺菌作用，或許可以作為一種防齲方法應用于臨床。Furusawa等[58]使用噬菌體來治療銅綠假單胞菌引起的馬角膜炎取得良好的效果。

噬菌體的內溶素最具價值的特性之一是細菌難以形成內溶素抵抗[59]。內溶素降解細胞壁中的肽聚糖，從而破壞細胞壁釋放子代噬菌體。噬菌體內溶素（endolysin） 對多株腸球菌[60]、多重耐藥鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）[61]等革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖具有良好的裂解作用。對天然內溶素進行截短或嵌合改造，可以提高其熱穩(wěn)定性，擴展宿主譜[62-63]。Yves 等[64]等通過融合多聚陽離子九肽構建出內溶素Artilysins 有效治療革蘭陰性菌感染。內溶素治療生效快，無毒力因子轉導的風險，無免疫原性。

噬菌體的免疫原性不僅與動物機體產生免疫應答[65]，同樣細菌也可以產生“噬菌體抗性”來抵抗噬菌體的感染。反之，噬菌體通過改變自身裂解周期、突變衣殼蛋白或尾絲蛋白以及編碼anti-CRISPRs 等[66-67]來逃避細菌抗性，這種共生進化動態(tài)影響噬菌體的治療效果，也是今后研究的方向之一。

4 展望

目前從口腔致病菌中分離出的噬菌體數(shù)量較少，需要更多的噬菌體分離鑒定以期用于口腔感染性疾病的治療。大力開展以噬菌體為材料的新型臨床非抗生素抗菌治療方法迫在眉睫?？谇晃⑸锝M中的噬菌體相互作用仍然需要探索，在噬菌體的幫助下可以更好的發(fā)展口腔“微生物組工程”，以預防和控制口腔感染性疾病。