疊氮溴化丙錠結(jié)合熒光定量PCR 測定布魯氏菌活菌數(shù)方法的建立

張士軍，常恒禎，王路鹿，翟菲菲，鞠丹迪，胡 盼，盧士英，李巖松，周 玉，柳增善，李兆輝，任洪林

（吉林大學(xué) 人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡稱“布病”，是由胞內(nèi)寄生菌--布魯氏菌（Brucella）引起的人獸共患傳染病，可感染人類和多種家畜[1]?；疾游锉憩F(xiàn)出盜汗、關(guān)節(jié)疼痛、懷孕母畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎等臨床癥狀，導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題，我國將其列為乙類傳染病[2-3]。隨著布魯氏菌致病機(jī)致研究的開展，探究布魯氏菌在宿主體內(nèi)或胞內(nèi)生存狀態(tài)、數(shù)量及其與宿主平衡關(guān)系愈來愈重要，特別是機(jī)體內(nèi)或胞內(nèi)是否存在活布魯氏菌及其數(shù)量已經(jīng)成為評估布魯氏菌毒力[4]、布病感染以及疫苗免疫效果[5]的重要指標(biāo)之一。目前主要以平板計(jì)數(shù)法測定布魯氏菌活菌數(shù)，但該方法耗時(shí)、工作量大、結(jié)果往往因個(gè)人主觀因素造成較大誤差[6]，而且體內(nèi)或胞內(nèi)的非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but not culturable，VBNC）的細(xì)菌也不能在常規(guī)的培養(yǎng)條件下生長[7-8]。因此需要建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的測定布魯氏菌活菌數(shù)的方法。

疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）是一種能與DNA 分子結(jié)合的染料，該染料可以進(jìn)入DNA分子的小溝中，在光的作用下使PMA 分解產(chǎn)生一種氮烯類物質(zhì)與DNA 分子發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，這種共價(jià)交聯(lián)物可抑制DNA 的PCR 擴(kuò)增[9]。死亡后細(xì)菌的膜完整結(jié)構(gòu)破壞， PMA 可以透過受損細(xì)胞膜與死亡菌的DNA 結(jié)合，從而抑制對其DNA 的PCR 擴(kuò)增，而此時(shí)PCR 只能擴(kuò)增出活菌的基因，從而實(shí)現(xiàn)對活菌的檢測[10]。布魯氏菌外膜蛋白31（Brucella cell surface protein 31 ku，bcsp31）是其重要的外膜結(jié)構(gòu)蛋白，Baily 等人證明編碼該蛋白的基因（bcsp31）存在于不同種的布魯氏菌中，Mayfield 等人曾對該基因進(jìn)行了克隆和測序，證明該基因在布魯氏菌屬中較為保守，因而利用其能鑒別所有種的布魯氏菌[11-13]。也有研究者將bcsp31 基因作為檢測布魯氏菌的重要靶分子[14]?；诖耍狙芯繉MA 與qPCR 技術(shù)相結(jié)合，以布魯氏菌bcsp31 基因?yàn)闄z測靶標(biāo)，建立測定布魯氏菌活菌數(shù)的疊氮溴化丙錠--熒光定量PCR（PMA-qPCR）方法，以期為胞內(nèi)布魯氏菌活菌數(shù)測定和其它評估布魯氏菌活菌數(shù)的相關(guān)領(lǐng)域工作，提供一種快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及細(xì)胞 豬種布魯氏菌弱毒株S2（Brucella suis S2 CVCC 22）、大腸桿菌模式株（Escherichia coli CMCC 44817）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium CGMCC 1.1194）、小腸結(jié)腸炎耶氏菌（Yersinia enteroco?litica CMCC 52208）、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyti?cus CGMCC 1.1616）、小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 由吉林大學(xué)人獸共患病研究所細(xì)菌病研究室保存。

1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提純化試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；PMA 購 自Biotium 公 司；Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）購自Roche 公司；布氏肉湯培養(yǎng)基購自青島日水生物技術(shù)有限公司；Triton X-100購自上海生工技術(shù)有限公司。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備、鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取布魯氏菌弱毒株S2 基因組，利用酶標(biāo)儀檢測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)牛種布魯氏菌（B.abortus）外膜蛋白基因bcsp31（M20404.1）序列，利用Premier Primer 5 設(shè)計(jì)1 對特異性引物：5'-AAACATCAAATCGGTCGC-3'/5'-CCGCCCACAAAGAAATAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為200 bp，引物由長春庫美生物科技有限公司合成。以提取的S2基因組為模板，采用上述引物PCR擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，對其進(jìn)行PCR 及測序鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒測定其濃度，并按公式換算成相應(yīng)拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=濃度（ng/μL）×阿佛加德羅常數(shù)（NA）×10-9/（660×重組質(zhì)粒的堿基數(shù)），作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存?zhèn)溆?。以該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做為模板，將退火溫度在為50 ℃～60 ℃、引物濃度在0.25 μmol/L～0.75 μmol/L 進(jìn)行qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后（101～107）分別作為模板，利用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以到達(dá)閾值的平均循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)公式：E=10-1/k-1（k 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率），算出其擴(kuò)增效率E。

1.4 PMA 對布魯氏菌S2 處理?xiàng)l件的優(yōu)化 PMA 與布魯氏菌DNA 的結(jié)合與曝光時(shí)間與PMA 的濃度有關(guān)，所以對其曝光時(shí)間及濃度進(jìn)行優(yōu)化：①取7 份相同濃度熱致死的布魯氏菌S2 菌液各500 μL，其中1份不加PMA 做對照，其余6 份分別加入PMA 使其終濃度為15 μg/mL，用650 W 鹵素?zé)舴謩e對樣品經(jīng)不同時(shí)間（0、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）曝光后，經(jīng)建立的PMA-qPCR 方法檢測，以確定最佳曝光時(shí)間。②取7 份相同濃度熱至死的布魯氏菌S2菌液各500 μL，分別加入不同濃度的（0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL）PMA，按照最佳曝光時(shí)間處理，經(jīng)建立的PMAqPCR 方法檢測，確定PMA 能夠完全抑制死菌DNA擴(kuò)增的最佳濃度。③取6 份同濃度的S2 活菌菌液各500 μL，分別加入不同濃度的（0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL）PMA，按照最佳曝光時(shí)間處理，經(jīng)建立的PMA-qPCR 方法檢測，以確定不影響活菌DNA擴(kuò)增的最佳PMA濃度。

1.5 PMA-qPCR 方法的特異性試驗(yàn) 分別利用PMA 最佳條件處理并提取大腸桿菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、副溶血弧菌、S2 株的基因組作為模板，按照本研究建立的PMA-qPCR 方法擴(kuò)增，設(shè)無RNase 水為陰性對照，重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照；同時(shí)利用1.3 的引物進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，評估本研究建立的PMA-qPCR方法的特異性。

1.6 PMA-qPCR 方法的敏感性試驗(yàn) 按照PMA 最佳條件處理2.0×108cfu/mL 的S2 活菌菌液后，提取其基因組DNA，將其10 倍倍比稀釋（2.0×108cfu/mL～2.0×10-1cfu/mL）后分別作為模板，進(jìn)行PMA-qPCR擴(kuò)增；同時(shí)提取未經(jīng)PMA 處理過的相同濃度的S2活菌基因組，10 倍倍比稀釋后作為模板，進(jìn)行常規(guī)qPCR 擴(kuò) 增；利 用1.3 的 引 物，經(jīng) 常 規(guī)PCR 對 上 述PMA 處理過的各稀釋度菌液基因組進(jìn)行擴(kuò)增，評估建立的PMA-qPCR 方法的敏感性。

1.7 PMA-qPCR方法的重復(fù)性試驗(yàn) 按照PMA最佳條件處理2.0×108cfu/mL S2活菌菌液，分3批次提取其基因組，均將其10 倍倍比稀釋（2.0×108cfu/mL～2.0×10-1cfu/mL）。選擇同批次提取的濃度為105cfu/mL～107cfu/mL 的S2 菌液基因組DNA 作為模板進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）；選擇不同批次濃度為105cfu/mL～107cfu/mL 的S2 菌液基因組DNA 作為模板進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算批間變異系數(shù)（CV），評估本研究建立的PMA-qPCR方法的重復(fù)性。

1.8 PMA-qPCR 對不同比例的S2 活菌數(shù)的測定將濃度為6.5×108cfu/mL 的S2 活菌和死菌菌液按活菌占比為0、10%、30%、50%、70%、100%的比例混合，取各混合菌液1 mL 加入15 μg/mL 的PMA 經(jīng)10 min 曝光處理后提取混合菌液基因組DNA 進(jìn)行PMA-qPCR 定量檢測，同時(shí)以不加PMA 處理的各混合菌液樣品經(jīng)常規(guī)qPCR 定量檢測，比較二者的檢測結(jié)果。

1.9 PMA-qPCR 法與平板計(jì)數(shù)法對S2 菌液及巨噬細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量的測定 以TSB 培養(yǎng)基培養(yǎng)S2，提取其基因組后分別利用PMA-qPCR 和平板計(jì)數(shù)法測定未知濃度的S2 菌液濃度，隨后進(jìn)行細(xì)胞侵染試驗(yàn)：將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12 h 后換無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，分為A 和B 兩組，每組6 個(gè)孔（其中3 個(gè)孔做PMA-qPCR 擴(kuò)增，另外3 個(gè)孔做平板計(jì)數(shù)），A 組感染500 μL 濃度為1.28×1012cfu/mL 的S2 菌液，B 組感染500 μL 濃度為0.64×1012cfu/mL 的S2 菌 液，感 染1 h 后，經(jīng)Triton X-100 裂解細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)的布魯氏菌，經(jīng)最佳條件的PMA 處理后，提取布魯氏菌基因組作為模板，利用PMA-qPCR 測定胞內(nèi)布魯氏菌活菌，將所得Ct 值帶入構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出活菌基因組拷貝數(shù)，再根據(jù)體系中模板的體積，換算出樣品中的活菌濃度；同時(shí)利用平板計(jì)數(shù)法對細(xì)胞裂解后的胞內(nèi)布魯氏菌活菌數(shù)進(jìn)行測定，并將兩種方法得出的活菌數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)t 檢驗(yàn)，當(dāng)p＜0.05 時(shí)差異顯著，p＞0.05 時(shí)無顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以布魯氏菌S2 基因組為模板，使用1.3 中合成的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的片段長度約為200 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖略）；構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-18T-bcsp31 經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增出大小約為200 bp 的目的條帶。測序結(jié)果也顯示，插入的bcsp31 基因序列正確，表明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。重組質(zhì)粒經(jīng)測定濃度為398.408 ng/μL；經(jīng)公式換算得出約為6.28×1010拷貝/μL。

2.2 qPCR 方法的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 優(yōu)化后的qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）10 μL，模板2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL；優(yōu)化后的反應(yīng)程序 為： 94 ℃2 min， 94 ℃45 s， 55 ℃30 s， 72 ℃32 s，40 個(gè)循環(huán)。以不同稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板經(jīng)優(yōu)化后的qPCR 方法擴(kuò)增獲得該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其回歸方程為：y=-3.492 x+36.303，其中y 代表Ct 值，x 代表基因拷貝數(shù)的對數(shù)值；R2=0.999，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct 值與拷貝數(shù)的對數(shù)值之間的線性關(guān)系良好，根據(jù)公式算得擴(kuò)增效率為93.36%。

2.3 最佳PMA 處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果 對PMA 的最佳曝光時(shí)間、最適濃度進(jìn)行優(yōu)化。不同曝光時(shí)間結(jié)果顯示，隨著曝光時(shí)間的延長，Ct 值不斷增大，當(dāng)曝光時(shí)間≥10 min 時(shí)各個(gè)曝光時(shí)間點(diǎn)的Ct 值均無顯著差異（p＞0.05）（圖2A）；不同濃度PMA 對熱致死菌作用的結(jié)果顯示，隨著PMA 濃度的增大，擴(kuò)增的Ct 值不斷增大，但當(dāng)濃度為≥15 μg/mL 時(shí)，目的基因無擴(kuò)增表明PMA 完全抑制了熱致死菌的DNA 擴(kuò)增（圖2B）；PMA 對活菌作用的結(jié)果顯示，當(dāng)PMA 濃度在0～15 μg/mL時(shí)，S2基因組擴(kuò)增的Ct值均無顯著差異（p＞0.05），當(dāng)PMA濃度繼續(xù)增大時(shí)，Ct值明顯增高（圖2C），表明較高濃度的PMA 會影響對活菌DNA 的PCR擴(kuò)增。綜合上述結(jié)果，最終將PMA最佳曝光時(shí)間確定為10 min，最適濃度確定為15 μg/mL。

圖1 qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve for qPCR based on the template of recombinant plasmid standard pMD-18T-bcsp31

圖2 PMA 處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of PMA treatment conditions

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以提取PMA 處理過的大腸桿菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、副溶血弧菌、S2 菌株的基因組為模板，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，無RNase 水為陰性對照，利用本研究建立的PMA-qPCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，除了S2 菌株與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有特異性擴(kuò)增外，其余菌株及無RNase 水均呈無擴(kuò)增（圖3A）。并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，當(dāng)Tm 值在87.87 ℃～88.36 ℃時(shí)熔解曲線呈單一熔解峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增（圖3B），同時(shí)常規(guī)PCR 結(jié)果也與PMA-qPCR 結(jié)果一致（圖3C）。表明本研究建立的PMA-qPCR 方法特異性較強(qiáng)。

圖3 PMA-qPCR 的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of the specificity test of the PMA-qPCR

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 提取PMA 處理過的S2 菌株基因組，10 倍倍比稀釋后作為模板，采用PMA-qP?CR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)菌液濃度在2.0×103cfu/mL～2.0×108cfu/mL 范 圍 內(nèi)，布 魯 氏 菌S2 經(jīng)PMA 處 理（PMA-qPCR 方法檢測）和未經(jīng)處理（常規(guī)qPCR 檢測）的擴(kuò)增曲線基本吻合（圖3A）。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PMA-qPCR 的敏感性為103cfu/mL（圖4A）。常規(guī)PCR 擴(kuò)增PMA 處理過的布魯氏菌S2 基因組結(jié)果顯示，其敏感性為105cfu/mL（圖4B），PMA-qPCR 敏感性是常規(guī)PCR 的100 倍。表明本研究建立的方法可對布魯氏菌活菌數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，且一定濃度的PMA 不對qPCR 的擴(kuò)增造成干擾。

圖4 PMA-qPCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of the PMA-qPCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 選擇105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL 3 個(gè)稀釋度的S2 菌液DNA 進(jìn)行批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)平均Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）計(jì)算批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）。結(jié)果顯示，批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均為0.63%～2.04%（表1），表明PMA-qPCR的穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。

表1 PMA-qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Repeatability test of the PMA-qPCR

2.7 PMA-qPCR 對不同比例的S2 活菌數(shù)的檢測結(jié)果 將已知濃度的S2 活菌與死菌按不同比例混合并經(jīng)PMA 處理后，提取不同比例的混合菌液基因組作為模板，進(jìn)行PMA-qPCR 擴(kuò)增，同時(shí)以不加PMA處理的樣品作對照（qPCR 擴(kuò)增）。結(jié)果顯示，隨著活菌比例的增高，PMA-qPCR 的Ct 值逐漸降低，但均高于未經(jīng)PMA 處理過的qPCR 的Ct 值，當(dāng)活菌含量為100%時(shí)，二者Ct 值無明顯差異（p＞0.05）；可見隨著活菌比例逐漸增大至100%時(shí)，PMA-qPCR 檢測結(jié)果與qPCR 檢測結(jié)果也更接近（圖5），表明PMA有效抑制了樣品中死菌DNA 的擴(kuò)增，同時(shí)也表明一定濃度的PMA 對活菌檢測無影響，且PMA-qPCR 方法可對活菌數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖5 PMA-qPCR 對不同比例的S2 活菌數(shù)的檢測結(jié)果Fig.5 Results of different proportions of viable B.suis S2 detected by PMA-qPCR

2.8 PMA-qPCR 與平板計(jì)數(shù)法對S2 菌液及巨噬細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量的測定結(jié)果 采用PMA-qPCR 與平板計(jì)數(shù)法分別測定S2 菌液的濃度。結(jié)果顯示，PMA-qPCR 測得菌液濃度為2.69×107cfu/mL，平板計(jì)數(shù)法測得菌液濃度為2.28×107cfu/mL，兩種方法測得菌液濃度數(shù)量級吻合且差異不顯著（p=0.07）；隨后采用這兩種方法分別對感染不同濃度S2 活菌（1.28×1012cfu/mL、 0.64×1012cfu/mL）的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)進(jìn)行測定，利用所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得出活菌數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示， A 組胞內(nèi)活菌數(shù)經(jīng)PMA-qPCR 法與平板計(jì)數(shù)法測得結(jié)果分別為3.24×104cfu/mL 和1.17×104cfu/mL，二者結(jié)果差異顯著（p=0.048）；B 組胞內(nèi)活菌數(shù)經(jīng)兩種方法測得結(jié)果分別為8.82×103cfu/mL 和1.2×103cfu/mL，二者結(jié)果仍差異顯著（p=0.042），但兩組經(jīng)這兩種方法測得的活菌數(shù)在一個(gè)數(shù)量級并與侵染的活菌數(shù)呈正相關(guān)，且活菌數(shù)量變化趨勢一致（圖6）。表明所建立的PMA-qPCR 方法可對樣品中布魯氏菌活菌數(shù)進(jìn)行簡便快速地定量檢測。

圖6 PMA-qPCR 法與平板計(jì)數(shù)法對布魯氏菌S2 菌液及巨噬細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)的測定結(jié)果（單位：cfu/mL）Fig.6 Result of determination of the amount of the viable B.suis S2 strain in bacterial suspensions and within macrophages by PMA-qPCR and plate counting(Unit:cfu/mL)

3 討 論

細(xì)菌的分離鑒定作為檢測布魯氏菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”存在著耗時(shí)，操作危險(xiǎn)的缺點(diǎn)；布魯氏菌的血清學(xué)檢測方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）等，這些方法敏感性、特異性較強(qiáng)，但存在假陽性等缺點(diǎn)[15]；其分子生物學(xué)檢測方法主要為PCR 及其衍生技術(shù)，但常規(guī)PCR 方法只能根據(jù)產(chǎn)物量推算起始量，操作易引入系統(tǒng)誤差，只能達(dá)到半定量[16]；而熒光定量PCR 方法可以監(jiān)測每輪DNA 擴(kuò)增的熒光信號，達(dá)到絕對定量或相對定量的目的，靈敏性和準(zhǔn)確性更高，是目前應(yīng)用較廣的定量方法[17]。常用于布魯氏菌檢測的靶基因主要有omp25、16S rDNA、is711、bcsp31 等。bcsp31 為單拷貝基因，被多國學(xué)者證實(shí)該基因在各個(gè)種的布魯氏菌中均高度保守，可特異、敏感、可靠的用于布魯氏菌的核酸檢測[11]。所以本研究選用bcsp31 基因作為建立PMA-qPCR 方法的靶基因。

布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，被其侵染的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液處理后，胞內(nèi)活布魯氏菌仍具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌質(zhì)膜的保護(hù)下PMA 不能與活布魯氏菌DNA 結(jié)合，從而使得活菌DNA 能夠被PCR 擴(kuò)增；而死亡布魯氏菌質(zhì)膜已損壞，PMA 可以穿過其質(zhì)膜而與該菌DNA 結(jié)合，從而抑制死菌DNA 的PCR擴(kuò)增[18-19]。先前研究表明過高濃度的PMA 對活細(xì)菌具有一定的毒性，可以破壞細(xì)菌正常的膜結(jié)構(gòu)并與其DNA 結(jié)合，從而抑制活菌DNA 的PCR 擴(kuò)增[18]；而與死菌結(jié)合后多余的PMA 也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，利用650 W 鹵素?zé)魧褐械腜MA 進(jìn)行曝光，曝光后的PMA 發(fā)生鈍化反應(yīng)而失活，這樣就能消除多余PMA 對活菌DNA PCR 擴(kuò)增的影響。為確保有足夠的PMA 能完全結(jié)合死菌DNA，又要確保該濃度下的PMA 不會對活菌的擴(kuò)增造成影響，在PMA的實(shí)際應(yīng)用中往往需要對其作用濃度及曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[20]。本研究對其優(yōu)化的結(jié)果為PMA 濃度為15 μg/mL，對其曝光時(shí)間為10 min，其可最大限度的抑制死菌DNA 的PCR 擴(kuò)增，又能使活菌DNA 得到有效擴(kuò)增。

Nogva 等首次將疊氮類染料結(jié)合PCR 技術(shù)應(yīng)用于活細(xì)菌檢測[21]，但目前未見將該技術(shù)用于測定布魯氏菌活菌數(shù)的研究報(bào)道。本研究首次將PMA 與qPCR 結(jié)合，經(jīng)各反應(yīng)條件與PMA 濃度與曝光時(shí)間的優(yōu)化，建立了用于快速定量測定布魯氏菌活菌的PMA-qPCR 方法。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，可用于布魯氏菌活菌數(shù)的快速定量檢測。

本研究又將該方法的實(shí)用性做了評估：同時(shí)采用PMA-qPCR 和常規(guī)qPCR 測定同濃度的布魯氏菌S2 活菌菌液濃度，結(jié)果顯示， PMA-qPCR 擴(kuò)增曲線與qPCR 擴(kuò)增曲線基本吻合，表明經(jīng)優(yōu)化條件處理的PMA 不影響qPCR 對活菌DNA 的擴(kuò)增；又利用本研究建立的PMA-qPCR 方法與平板計(jì)數(shù)法分別對TSB 純培養(yǎng)的布魯氏菌S2 菌液及其侵染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)布魯氏菌活菌數(shù)進(jìn)行定量測定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示PMA-qPCR 方法與平板計(jì)數(shù)法對純培養(yǎng)的S2 活菌的測定結(jié)果無顯著差異，但利用這兩種方法對胞內(nèi)活菌數(shù)的測定結(jié)果卻差異顯著，平板計(jì)數(shù)法測定值小于PMA-qPCR 的測定值，分析可能有以下原因：1、平板計(jì)數(shù)結(jié)果往往容易受個(gè)人主觀因素影響造成該方法的結(jié)果產(chǎn)生誤差；2、Triton X-100 裂解液可能抑制了細(xì)菌在平板上的生長；3、感染細(xì)胞內(nèi)部分活布魯氏菌可能進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，無法實(shí)現(xiàn)體外平板培養(yǎng)出能肉眼可見的菌落[22-24]；4、本研究建立的方法為一種絕對定量方法，計(jì)算結(jié)果依賴于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而實(shí)際樣品成分復(fù)雜，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果存在誤差。盡管PMA-qPCR 方法與平板計(jì)數(shù)法測定的結(jié)果差異顯著，但二者測定的活菌數(shù)量級和變化趨勢一致，且均與侵染的布魯氏菌數(shù)量呈正相關(guān)。但PMA-qPCR方法測定活菌數(shù)量的時(shí)間卻大大縮短，還可同步實(shí)現(xiàn)布魯氏菌的定性定量檢測，具有一定的可應(yīng)用性，為研發(fā)新型布魯氏菌活菌數(shù)快速檢測方法做了有意義的探索。

綜上，本研究以布魯氏菌bcsp31 基因?yàn)闄z測靶標(biāo)，建立了快速定量測定布魯氏菌活菌數(shù)的PMA-qPCR 方法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，可以同步實(shí)現(xiàn)布魯氏菌的定量和定性檢測，為布魯氏菌活菌數(shù)快速測定提供了可行方法。