表面展示副結(jié)核分枝桿菌抗原MAP3007 的大腸桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建與免疫效力評價

許 秋，周 薇，丁仕豪，張 卓，陸 瑤，劉思國，于申業(yè)

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

副結(jié)核病（Paratuberculosis）是由禽分枝桿菌副結(jié)核 亞 種（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis，MAP）引起的以反芻動物為主的腸道慢性消耗性疾病，主要導致肉芽腫性腸炎、持續(xù)性腹瀉、逐漸消瘦和死亡[1-2]。副結(jié)核分枝桿菌宿主范圍非常廣泛，特別是奶牛、綿羊，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。此外，副結(jié)核分枝桿菌與人類的克羅恩病之間也存在一定的聯(lián)系，表明這種病原體也可能是一個重要的公共安全問題[5-6]。

副結(jié)核病目前世界范圍內(nèi)尚無經(jīng)濟有效的治療藥物，因此研發(fā)高效的疫苗顯得尤為重要。細菌表面展示平臺在疫苗研制方面有較為廣泛的應用，其在疫苗設計方面具有獨特的優(yōu)勢，它將抗原遞呈在細菌表面，這樣使呈現(xiàn)在細菌表面的多肽抗原更容易被免疫系統(tǒng)識別。此外，展示細菌大腸桿菌的脂多糖和外膜蛋白均具有較強免疫原性，可以作為所展示的外源蛋白的天然免疫佐劑，并且對疫苗生產(chǎn)條件要求低，易于大規(guī)模生產(chǎn)，方便運輸，在新型疫苗的研制方面具有廣闊的應用前景。因此，本研究借助INP 錨定序列將副結(jié)核分支桿菌蛋白MAP3007 展示至大腸桿菌表面，利用所構(gòu)建的表面活載體疫苗免疫小鼠，檢測小鼠細胞免疫和體液免疫，以期為新型副結(jié)核病疫苗的研制奠定基石。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 E.coli DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞、細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq DNA Polymerase 購自TaKaRa 公司；Nde Ι、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific 公司；多肽MAP3007cpep 由博仕生物公司合成；APC、PE 標記的CD4+和CD8+T 細胞抗體均購自Southern Biotech 公司；MILLIPLEX Mouse Th17 Magnetic Bead Kit 為Millipore 公司產(chǎn)品；小鼠脾臟組織淋巴細胞分離液試劑盒購自TBD 公司；副結(jié)核分枝桿菌K-10 標準株由本實驗室保存，pET-INP表達載體由本實驗室前期構(gòu)建。6 周齡～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華公司。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與目的蛋白的表達 根據(jù)GenBank 中副結(jié)核分枝桿菌K-10 株基因組序列（NC_002944），設計特異性引物F：5'-TTTCCATGGTGAC TGGCGAGTCGGGCTCC-3'/R：5'-TTTAAGCTTGGAGC CCTCGTAGGTGTC-3'，以提取的副結(jié)核分枝桿菌K-10 基因組為模板擴增目的基因map3007，連接至pET-INP 載體，經(jīng)PCR 鑒定后構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名pET-INP-MAP3007。 按常規(guī)方法將pET-INPMAP3007重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm=0.6 時加終濃度1 mmol/L IPTG 繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h 后離心收集菌體，超聲破碎后3 000 r/min 4 ℃離心5 min，分離上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測后轉(zhuǎn)膜，以抗6×His 抗體（1∶10 000）為一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測目的蛋白表達情況。同時設pET-INP 空載體轉(zhuǎn)化為對照。

1.3 目的蛋白的定位分析

1.3.1 目的蛋白的亞細胞定位 取適量1.2 中誘導后收集的菌體，0.1 mol/L PMSF 重懸，超聲裂解后3 000 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清，沉淀用TE 緩沖液重懸，然后27 000 r/min 4 ℃離心1 h，收集上清，用10 mmol/L 的碳酸氫銨重懸沉淀，即為細胞壁成分；將兩次收集的上清100 000 r/min 4 ℃離心4 h后，上清部分即為胞漿成分；此時用10 mmol/L 的碳酸氫銨重懸的沉淀，即為細胞膜成分。分別采用SDS-PAGE 檢測后轉(zhuǎn)膜，以抗6×His 抗體（1∶10 000）為一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測目的蛋白在細胞膜、細胞漿、細胞壁中的表達情況。

1.3.2 檢測表面蛋白INP-MAP3007 的蛋白酶消化實驗 取適量1.2 中誘導后收集的菌體，PBS 重懸后以500 μL/管分裝至3個EP管中，分別標記為1，2，3號樣品。將1 號樣品始終置于冰上，在2 號樣品中加入20 μL 25 mmol/L 的CaCl2和2.5 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，3號樣品只加20 μL 25 mmol/L的CaCl2，均37 ℃放置20 min，取出2 與3 號樣品各加入6 μL 200 mmol/L的EDTA。將1、2 及3 號樣品10 000 r/min 離心2 min，棄上清，沉淀用冰浴的PBS 重懸后，以抗6×His 抗體（1∶10 000）為一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，分別經(jīng)western blot 檢測目的蛋白在細菌外膜的表達情況。

1.3.3 表面蛋白INP-MAP3007 的流式檢測 將37 ℃過夜培養(yǎng)的重組菌INP-MAP3007 和INP-28a 分別轉(zhuǎn)接5mL LB，當菌液培養(yǎng)至OD600nm=0.6 時加入IPTG 誘導培養(yǎng)4 h。然后取1mL 離心PBS 重懸后稀釋菌液到OD600nm=0.8，用4%組織細胞固定液室溫固定30 min，加入適量含1%BSA 的PBS 稀釋帶PE 標記的6×His 抗體，冰上孵育1 h，PBS 洗滌并重懸，加入帶濾網(wǎng)的流式細胞管后，利用流式細胞儀檢測目的蛋白在細菌表面是否表達。

1.4 小鼠免疫及攻毒試驗 選取6 周齡～8 周齡的Balb/C 雌性小鼠110 只隨 機 分為4 組：PBS 組30 只，INP-28a 對照組30 只，INP-MAP3007 重組菌免疫組30 只，空白未攻毒組20 只（僅用于增重試驗和病理組織學試驗）。其中INP-28a 與INP-MAP3007 組以5×105cfu/200 μL/只分別免疫INP-28a 空菌與INPMAP3007 重組疫苗，PBS 組注射等體積PBS，對小鼠進行3 次免疫，每次免疫間隔為兩周，然后以副結(jié)核分枝桿菌K-10 標準株進行腹腔注射攻毒，劑量為5×108cfu/200 μL/只，空白對照組不做處理。整個實驗期以初次免疫開始計算時間，二次免疫在第2 周，三次免疫在第4 周，攻毒在第6 周。

1.5 小鼠血清IgG 抗體的檢測 分別于首免后第

2、4、6 周采集各組小鼠血液，分離血清，通過間接ELISA方法[7]測定每組小鼠特異性抗體IgG的水平。

1.6 小鼠細胞因子IL-10、IFN-γ和IL-4 檢測 將初次免疫后第2 周，4 周（二免后2 周），6 周（三免后2 周），8 周（攻毒后2 周），14 周（攻毒后8 周）采集的各組小鼠血清樣品，利用MILLIPLEX 細胞因子檢測試劑盒檢測各組小鼠的IL-10、INF-γ、IL-4 細胞因子水平。

1.7 小鼠CD4+、CD8+T細胞數(shù)量及百分比的測定分別于初次免疫后第2、4、6 周，每組隨機迫殺3只小鼠，無菌摘取脾臟，分離脾淋巴細胞，采用1640 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，通過計數(shù)調(diào)整細胞濃度，加入12 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞以MAP3007cpep多肽37 ℃刺激24 h，收集培養(yǎng)細胞，PBS 洗滌3次，分別加入APC 標記的羊抗小鼠CD4+抗體和PE標記的羊抗小鼠CD8+抗體，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌3 次，流式細胞儀檢測各組小鼠CD4+和CD8+T 細胞數(shù)量并計算二者的比值。

1.8 攻毒后小鼠增重率的變化 于初次免疫后第6周（攻毒時）、10 周（攻毒后4 周）、14 周（攻毒后8 周）對各組小鼠稱重，通過小鼠體質(zhì)量變化計算小鼠增重率變化，觀察攻毒后對各組小鼠體重的影響。

1.9 攻毒后小鼠組織病理變化的檢測 于初次免疫后第8 周（攻毒后2 周）、第10 周（攻毒后4 周）、第12 周（攻毒后6 周），每組隨機處死3 只小鼠，無菌摘取小鼠的脾臟、肝臟和結(jié)腸，放入福爾馬林中固定，制作病理切片，觀察各組小鼠組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與目的蛋白的表達 利用載體通用引物對構(gòu)建的pET-INP-MAP3007 重組質(zhì)粒進行PCR 鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒目的條帶大小與預期大小一致，進一步經(jīng)測序比對確認正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-INP-MAP3007。將其轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中獲得重組菌INP-MAP3007，IPTG 誘導表達后經(jīng)western blot 檢測，結(jié)果顯示在52 ku 處有特異性條帶，與預期INP-MAP3007 蛋白大小一致，且主要在沉淀中表達（圖1A）。以上結(jié)果初步表明獲得了副結(jié)核分支桿菌蛋白MAP3007 展示大腸桿菌。

2.2 目的蛋白的定位分析 通過亞細胞組份分離得到INP-MAP3007 重組菌的細胞膜、細胞漿、細胞壁成分，western blot 檢測結(jié)果顯示，INP-MAP3007蛋白存在于細胞膜和細胞漿組分中（圖1B）。將蛋白酶K 消化后的樣品進行western blot 分析，結(jié)果顯示，經(jīng)蛋白酶K 消化后的樣品中INP-MAP3007 蛋白條帶消失，而無蛋白酶K 消化的樣品均存在特異性的蛋白條帶，且蛋白大小與預期結(jié)果相一致（圖1C）。將重組菌INP-28a、INP-MAP3007 用PE 標記的6×His 抗體孵育后經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，INP-MAP3007 的熒光信號增強，而對照組INP-28a 無特異性的熒光信號（圖1D）。以上結(jié)果表明已將外源蛋白INP-MAP3007 展示在BL21 的表面。

圖1 MAP3007 蛋白的表達及定位分析Fig.1 Expression and localization analysis of INP-MAP3007 protein

2.3 小鼠血清IgG抗體的檢測結(jié)果 采用間接ELISA方法檢測免疫后各組小鼠抗體水平，結(jié)果顯示，初次免疫后2周時INP-MAP3007重組菌免疫組產(chǎn)生少量抗體，與PBS、INP-28a 對照組相比，差異不顯著（NS）。第二次免疫后2 周，重組疫苗組抗體水平明顯高于PBS、INP-28a 對照組，差異極顯著（p＜0.001），第三次免疫后2 周，抗體水平達到最高，與對照組差異極顯著（p＜0.001）（圖2）。表明INP-MAP3007 重組疫苗組能誘導小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平。

圖2 小鼠血清特異性IgG 抗體檢測Fig.2 Detection of the specific IgG antibody in sera

2.4 小鼠細胞因子IL-10、IFN-γ和IL-4 的檢測結(jié)果 采集各實驗組小鼠首免后各時間點血清，利用MILLIPLEX 細胞因子檢測試劑盒檢測各細胞因子的表達水平。結(jié)果顯示，INP-MAP3007 重組菌免疫組在初次免疫后2 周與4 周（二免后2 周）時，與PBS、INP-28a 對照組相比抗炎性細胞因子IL-10 相對水平較高，差異極顯著（p＜0.001）；在第8 周（攻毒后2周），INP-MAP3007 重組疫苗組IL-10 急劇較少，但與PBS、INP-28a 對照組相比差異不顯著（NS）；在第14 周（攻毒后8 周），INP-MAP3007 重組疫苗組IL-10 的產(chǎn)生明顯低于PBS、INP-28a 對照組，與對照 組 相 比 差 異 顯 著（p＜0.001）。在 免 疫 周 期 內(nèi)INP-MAP3007 重組疫苗組IFN-γ的水平均較低，與對照組相比差異不顯著（NS）；攻毒后INP-MAP3007重組疫苗組與對照組相比，IFN-γ相對水平較高，差異極顯著（p＜0.001）；INP-MAP3007 重組疫苗組IL-4 在4 周（二免后2 周）和6 周（三免后2 周）相對水平較高，與對照組相比差異顯著（p＜0.001），在攻毒后INP-MAP3007 重組疫苗組IL-4 水平降低， 但與PBS、INP-28a 對照組無差異（NS）（圖3）。表明，INP-MAP3007 疫苗組能激活細胞免疫，刺激小鼠機體產(chǎn)生大量細胞因子。

2.5 小鼠CD4+T、CD8+T細胞亞群數(shù)量及百分比的測定結(jié)果 利用流式細胞術(shù)分析各組小鼠脾臟淋巴CD4+T、CD8+T細胞進行，結(jié)果顯示，與對照組相比，INP-MAP3007 疫苗組的CD4+T、CD8+T 細胞均 顯 著 增 加（p＜0.001）；INP-MAP3007 疫 苗 組 的CD4+T/CD8+T 細胞比率均顯著高于對照組（p＜0.001）（圖4）。表明，INP-MAP3007 疫苗組能誘導小鼠體內(nèi)T 淋巴細胞增殖分化。

圖3 小鼠血清中細胞因子檢測Fig.3 Detection of cytokines in sera

圖4 小鼠CD4+T、CD8+T 細胞數(shù)量及二者比值的測定結(jié)果Fig.4 Detection of the number and the ratio of CD4+T and CD8+T cells in mice

2.6 攻毒后小鼠增重率的變化 對攻毒后不同時間的小鼠進行體重稱量，結(jié)果顯示，在第6 周（攻毒時）至第10 周（攻毒后4 周）時，INP-MAP3007 疫苗組和對照組小鼠體重均處于增長狀態(tài)，與空白未攻毒組小鼠增長基本一致，從圖5 中看出PBS、INP-28a 對照組增長緩慢，其它兩組增加較快；在第10 周（攻毒后4 周）至第14 周（攻毒后8 周）時，PBS、INP-28a 對照組小鼠體重減輕，但INP-MAP3007 疫苗組與空白未攻毒組生長速度基本一致。表明INP-MAP3007 展示疫苗可以顯著降低副結(jié)核分枝桿菌對小鼠生長的影響，攻毒后不會引起小鼠體重消瘦。2.7 病理組織學變化 分別對攻毒后不同時間小鼠的結(jié)腸、肝臟和脾臟進行病理組織切片觀察。結(jié)腸病理結(jié)果顯示，在初次免疫后8 周、10 周、12 周時，INP-28a 對照組均出現(xiàn)不同程度的黏膜層廣泛性壞死，可見桿狀細菌樣顆粒，固有層可見少量嗜中性粒細胞浸潤，而INP-MAP3007 展示疫苗組與空白未攻毒組均未出現(xiàn)顯著病變（圖6A）。

圖5 攻毒后小鼠增重率變化Fig.5 Changes in weight gain rate of mice after challenge

肝臟的病理結(jié)果顯示，在初次免疫后8 周、10周、12 周時，INP-28a 對照組均出現(xiàn)實質(zhì)內(nèi)多發(fā)性微型肉芽腫；而INP-MAP3007 展示疫苗組出現(xiàn)輕微病變，實質(zhì)內(nèi)可見微型肉芽腫；空白未攻毒組無顯著病變（圖6B）。

脾臟的病理結(jié)果顯示，在初次免疫后8 周時，INP-28a 對照組中紅髓可見嗜中性粒細胞浸潤；INP-MAP3007 展示疫苗組與空白未攻毒組均未出現(xiàn)顯著病變。在初次免疫后10 周時，INP-28a 對照組中紅髓可見微型肉芽腫伴嗜中性粒細胞浸潤；INP-MAP3007 展示疫苗組中出現(xiàn)微型肉芽腫；空白未攻毒組無顯著病變。在初次免疫后12 周時，INP-28a 載體對照組中紅髓可見壞死細胞及少量嗜中性粒細胞浸潤；INP-MAP3007 展示疫苗組中可見微型肉芽腫；空白未攻毒組無顯著病變（圖6C）。

圖6 攻毒后各組小鼠結(jié)腸、肝臟、脾臟病理變化Fig.6 The pathological changes of colon,liver and spleen in mice of each group after challenge

以上PBS 組各組織的病理變化與INP-28a 對照組基本一致，故PBS 組病理圖片未展示。綜合上述結(jié)果表明，INP-MAP3007 展示疫苗對小鼠有一定的免疫保護作用。

3 討 論

一些國家將疫苗免疫作為有效防控副結(jié)核病的措施。目前副結(jié)核疫苗主要分為滅活苗和弱毒疫苗，常用的主要有羊副結(jié)核疫苗Gudair?[8]、Silirum滅活疫苗和Neoparasec 弱毒疫苗[9]，然而弱毒疫苗并不能對牛群提供完全的保護效果，部分個體會因接種弱毒苗而感染副結(jié)核分枝桿菌[10]，可能會干擾臨床診斷，對牛結(jié)核的皮試檢測存在交叉反應。有研究表明，副結(jié)核滅活苗免疫的群體與未使用滅活苗免疫的群體相比發(fā)病率并無顯著降低，所以目前該類疫苗仍然只能在限定范圍內(nèi)使用。因此研究開發(fā)具有良好保護力和有效性的疫苗對牛副結(jié)核病的防控與根除具有重要的意義[11]。

細菌表面展示系統(tǒng)可以將多種異源抗原表達展示于細菌外膜，并且其展示系統(tǒng)多種多樣，操作簡單，可以滿足不同的需求，在活載體疫苗研究方面有較廣泛的應用[12]。因此，本研究將編碼強免疫原性蛋白的MAP3007 基因亞克隆到前期構(gòu)建的pET-INP 展示載體，IPTG 誘導后在大腸桿菌BL21（DE3）中大量表達。進而通過蛋白酶K 消化實驗和流式細胞術(shù)檢測，證實該抗原成功展示在大腸桿菌外膜，獲得了表面展示活載體疫苗INP-MAP3007。

INP-MAP3007 能夠刺激小鼠產(chǎn)生高水平的細胞免疫和體液免疫。細胞免疫對于清除分枝桿菌等胞內(nèi)菌感染具有重要作用[13]。T 細胞受抗原刺激后分化為Th1、Th2、Treg 等效應細胞，分泌產(chǎn)生IFN-γ、IL-4、IL-10 及其它細胞因子，其中IFN-γ和IL-4 分別是評價Th1 型免疫反應和Th2 型免疫反應的常用指標。副結(jié)核感染過程中存在早期感染階段的Th1 優(yōu)勢反應向亞臨床和臨床階段的Th2 優(yōu)勢反應的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象[14]。本研究中感染小鼠也存在這種趨勢，INP-28a 對照組的IFN-γ水平在感染后第8 周至第14 周先升后降。疫苗組的IFN-γ水平在攻毒后有明顯的升高，且顯著高于對照組（p＜0.001），說明在同樣的感染時間內(nèi)INP-MAP3007 展示疫苗仍能維持高水平的Th1 型細胞免疫反應。Tc、NK、γδT、巨噬細胞活化后同樣可以分泌IFN-γ[15-16]，INPMAP3007 免疫組IFN-γ的高水平表達也可能與上述細胞的分泌有關(guān)，具體機制還需要進一步研究。此外，INP-MAP3007 免疫組誘導產(chǎn)生的CD4+T 和CD8+T 細胞均顯著高于對照組（p＜0.001），表明其能夠誘導機體CD4+T、CD8+T 細胞增殖活化，CD4+T細胞亞群包含對分枝桿菌感染有抵抗作用的Th1、Th2 和Treg 效應細胞。IL-10 是一種有效的抗炎性細胞因子，IL-10 在副結(jié)核分支桿菌的感染中發(fā)揮著重要作用，可能成為一種重要的診斷指標[17]，IL-10通過抑制促炎細胞因子的分泌，增強了巨噬細胞內(nèi)副結(jié)核分支桿菌的生長和持續(xù)存活，因此IL-10 分泌的降低對抑制副結(jié)核分支桿菌有重要意義[17]。本研究發(fā)現(xiàn)INP-MAP3007 免疫組攻毒后IL-10 明顯降低，尤其在初次免疫后第14 周時，與PBS 組相比IL-10 顯著降低，在攻毒后期IL-10 分泌減少可以更有效的抵抗副結(jié)核分支桿菌的感染。越來越多的研究表明，B 細胞在抗分枝桿菌感染中發(fā)揮著重要作用，本研究3 次免疫后，INP-MAP3007 免疫組較之PBS、INP-28a 對照組能產(chǎn)生更高水平IgG 抗體，說明INP-MAP3007 能夠刺激B 細胞活化分泌抗體。此外，B 淋巴細胞能夠與細胞免疫反應相互作用幫助機體抵抗細胞內(nèi)病原體（包括分枝桿菌）[18]，同時，B 細胞可作為抗原遞呈細胞活化T 細胞，進一步影響細胞因子的產(chǎn)生，對抵抗分枝桿菌的長期感染具有重要作用[19]。

持續(xù)腹瀉與消瘦是副結(jié)核病的重要臨床特征，經(jīng)過對小鼠體重測定發(fā)現(xiàn)INP-MAP3007 免疫組體重變化趨勢與空白未攻毒組相一致，并未引起小鼠消瘦。病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)INP-28a，PBS 對照組可見不同程度的細胞壞死和多發(fā)性微型肉芽腫；INPMAP3007 免疫組僅在肝臟中出現(xiàn)輕微的肉芽腫，腸與脾臟未出現(xiàn)明顯病變，說明INP-MAP3007 展示活菌疫苗對小鼠有一定的免疫保護作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建的INP-MAP3007 重組菌可誘導小鼠機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應，且維持小鼠增重，降低病理損傷程度，減緩病程，因此，其有望作為抵抗副結(jié)核的候選疫苗。本研究為副結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新思路。