歐洲鰻鱺T7 噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建、淘選及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)

徐元?jiǎng)P，林 鵬，王藝?yán)?，彭欣慰，馮建軍

（集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心/農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

鰻鱺，俗稱河鰻、鰻魚，隸屬輻鰭亞綱的鰻鱺目（Anguilliformes），味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，已成為中國(guó)、馬來西亞、日本等國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類[1]。目前，我國(guó)鰻鱺養(yǎng)殖總量約占世界的2/3，但高密度、集約化的養(yǎng)殖模式，引起鰻鱺病害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重制約鰻鱺產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是養(yǎng)殖魚類中常見的病原菌，能夠引起歐洲鰻鱺（Anguilla an?guilla）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）以及美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）敗血癥、爛鰓病、紅體病、肝臟充血等病癥發(fā)生[2]。在養(yǎng)殖病害的防治過程中，長(zhǎng)期使用抗生素和化學(xué)試劑會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加、水體污染和魚體中藥物殘留等問題，為解決現(xiàn)有養(yǎng)殖技術(shù)水平、養(yǎng)殖模式條件下的水產(chǎn)動(dòng)物病害問題，免疫預(yù)防技術(shù)受到越來越多的關(guān)注[3]。接種疫苗能夠有效激發(fā)魚體特異性免疫應(yīng)答，具有較好的免疫保護(hù)作用，是目前免疫防治的主要方法，但其特異性抗體的產(chǎn)生時(shí)間較長(zhǎng)，一般7 d～14 d 之后才出現(xiàn)特異性抗體，且至少經(jīng)過4 周后才能達(dá)到峰值[4]，這對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中暴發(fā)性的病害，以及免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的幼苗的免疫保護(hù)作用將受到限制。因此，利用基因工程技術(shù)大量、快速制備魚類同源性抗體，包被后以抗體微膠囊的形式通過口服途徑對(duì)魚類疾病進(jìn)行防治，有望為水產(chǎn)動(dòng)物病害的免疫學(xué)防治開辟新思路。

噬菌體抗體庫技術(shù)是一種新型抗體制備技術(shù)，該技術(shù)通過PCR 擴(kuò)增抗體的全套可變區(qū)基因，再利用噬菌體展示技術(shù)將單鏈抗體（Single-chainantibody variable fragment，scFv）或Fab 段 展 示 在 噬 菌 體 表面，通過生物淘選和抗體活性檢測(cè)后獲得特異性抗體[5]。目前，構(gòu)建噬菌體抗體庫最常見的方法是目標(biāo)動(dòng)物經(jīng)過抗原免疫后，構(gòu)建其脾臟或外周血淋巴細(xì)胞噬菌體免疫抗體庫，利用該方法已成功構(gòu)建了小鼠[6]、雞[7]等物種的scFv 庫。該方法的特點(diǎn)是能夠獲得針對(duì)特定抗原的高親和力抗體，但也存在制備周期長(zhǎng)、抗體庫多樣性較低的問題[8]。噬菌體天然抗體庫具有抗體庫容高、多樣性豐富的特點(diǎn)，主要通過未刺激的外周血淋巴細(xì)胞、脾臟和骨髓細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建，通過2～4 輪生物淘洗即可獲得針對(duì)多種不同抗原的特異性抗體[9]。

scFv 是噬菌體抗體庫中抗體形式之一，由抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過短多肽接頭連接而成[7]。其蛋白分子量小、免疫原性低且抗體本身無Fc 結(jié)構(gòu)域，可有效穿透組織屏障達(dá)到病灶部位，在人體和動(dòng)物內(nèi)不易引起免疫排斥，并與Fc受體的非靶細(xì)胞不易結(jié)合，在醫(yī)學(xué)診斷和疾病防治等方面有廣泛的應(yīng)用前景[10]。

本研究利用SOE-PCR 技術(shù)構(gòu)建健康歐洲鰻鱺脾臟scFv 基因庫，與T7 噬菌體載體進(jìn)行連接、包裝后獲得噬菌體scFv 庫，通過生物淘洗獲得針對(duì)鰻鱺主要病原菌嗜水氣單胞菌的特異性抗體，克隆其編碼基因，并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中高效表達(dá)，為養(yǎng)殖鰻鱺病原菌的免疫防治與檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 歐洲鰻鱺購自福建省福清養(yǎng)鰻場(chǎng)，平均體重約為50 g。大腸桿菌BL21、載體pGEX-4T-2、嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）、歐洲鰻鱺抗OMP 血清及天然歐洲鰻鱺血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存；T7 Se?lect10-3b Cloning Kit 購 自Novagen 公 司；TRIzol 試劑、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、NotⅠ購自Thermo Fisher Scientific 公司；RT-PCR 試劑盒、膠回收試劑盒、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、pMD19-T 載體均購自TaKaRa 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（HRP-IgG）購自Sigma-Aldrich 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中登錄的歐洲鰻鱺抗體VH 段基因序列（EF062515）、VL 段基因序列（EF031085）設(shè)計(jì)特異性引物，在VH、VL 擴(kuò)增引物中引入（Gly4Ser）3Linker 接頭序列（下劃線部分），在VH 引物上游、VL 引物下游分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ、Hind Ⅲ（斜體部分）；而用于原核表達(dá)的scFv 擴(kuò)增引物上下游分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ、NotⅠ（加粗部分）。引物序列見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 歐洲鰻鱺抗體VH、VL 段及scFv 目的基因片段擴(kuò)增引物Table 1 Primers sequences used for amplification of Anguilla anguilla VH,VL and scFv

1.3 歐洲鰻鱺scFv 基因的擴(kuò)增 解剖健康歐洲鰻鱺取脾臟組織100 mg，用液氮研磨成粉末狀，利用TRIzol 試劑提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，分別采用VH 引物VH-F/VH-R；VL引物VL-F/VL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃30 s、65 ℃30s（VL 此處為50.3 ℃）、72 ℃1 min，共38 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收VH、VL 基因片段。

取獲得的VH 基因（52 ng）、VL 基因（50 ng）為模板，進(jìn)行SOE-PCR 擴(kuò)增，通過（Gly4Ser）3Linker 將VH、VL 段拼接為完整的scFv 基因。程序?yàn)椋?4 ℃2 min；94 ℃30 s、62 ℃30 s、72 ℃1 min，共7 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，在產(chǎn)物中各加入1 μL 的VH-F/VL-R 引 物 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，程 序 為：94 ℃2 min；94℃30 s、58 ℃30 s、72℃1 min，共38個(gè)循環(huán)；72℃10 min，即得到完整的歐洲鰻鱺scFv基因序列。

1.4 噬菌體scFv 庫的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行噬菌體scFv 庫的構(gòu)建及庫容測(cè)定。將膠回收純化的scFv基因序列和T7 Select10-3b 噬菌體載體利用EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后進(jìn)行連接。取5 μL連接產(chǎn)物與25 μL T7 Packaging Extracts（試劑盒提供）室溫混合2 h 后加入270 μL LB 液體培養(yǎng)基終止反應(yīng)，構(gòu)建獲得T7 噬菌體原始抗體庫。取少量噬菌體溶液稀釋后，通過平板計(jì)數(shù)法對(duì)噬菌體原始抗體庫庫容進(jìn)行測(cè)定，并隨機(jī)從平板中挑取10 個(gè)噬菌斑接種于宿主菌BLT5403，增殖后提取DNA，以VH-F/VL-R 為引物，通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)scFv 基因序列與T7 Select10-3b 噬菌體載體的連接情況。宿主菌BLT5403 在含氨芐抗生素的M9TB 液 體 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) 至OD600nm值 約0.8 后 將 剩 余的噬菌體原始抗體庫全部加入，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)生溶菌，10 000 r/min 離心10 min 去沉淀，上清即為初級(jí)抗體庫，取少量上清稀釋后平板計(jì)數(shù)法測(cè)定噬菌體初級(jí)抗體庫滴度。

1.5 噬菌體scFv 庫的淘選 將嗜水氣單胞菌重組OMP 用碳酸鹽包被液稀釋至50 μg/mL，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板4℃過夜包被，PBST 洗滌3 次后加入5%BSA 封閉酶標(biāo)板1 h，加入10 μL 歐洲鰻鱺噬菌體scFv 庫溶液和90 μL TBST，室溫靜置50 min；PBST洗滌5 次后加入200 μL T7 Elution Buffer，20 min 后將每孔溶液8 000 r/min 離心3 min，取上清于BLT5403菌液進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，取擴(kuò)增后的噬菌體庫重復(fù)上述淘選過程，淘選4 次后取少量上清液，稀釋后鋪平板。隨機(jī)挑取10 個(gè)噬菌斑在宿主菌BLT5403 中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，破碎后取上清，即為相應(yīng)的噬菌體液，命名為T7-OMP-scFv，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 抗體特異性的阻斷ELISA 鑒定 將嗜水氣單胞菌重組OMP 作為抗原進(jìn)行包被，封閉及洗滌步驟同上。實(shí)驗(yàn)孔分別加入100 μL 等體積混合的10 個(gè)T7-OMP-scFv 噬菌體稀釋液（5 倍稀釋）和歐洲鰻鱺抗OMP 血清（1∶5），陰性對(duì)照孔加入100 μL 等體積混合的培養(yǎng)液和天然歐洲鰻鱺血清（1∶5），陽性對(duì)照孔中加入100 μL 等體積混合的培養(yǎng)液和歐洲鰻鱺抗OMP 血清（1∶5），每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行孔。隨后于各孔中加入兔抗IgM 血清（l∶1 000），以山羊抗免HRP-IgG（l∶6 000）為二抗，進(jìn)行阻斷ELISA。酶標(biāo)儀測(cè)定其OD450nm值，利用公式計(jì)算抑制率：抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)孔OD450nm-陰性對(duì)照OD450nm）/（陽性對(duì)照孔OD450nm-陰性對(duì)照OD450nm）]×100%。并將抑制率最高的T7-OMP-scFv 噬菌體命名為OMP-scFv。

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 取OMP-scFv 噬菌體稀釋液10 μL 加入100 μL 10 mmol/L EDTA（pH 8.0）混勻后65 ℃水浴裂解10 min，14 000 r/min 離心3 min，上清液即為噬菌體DNA。以噬菌體DNA 為模板，通過引物OMP-scFv-F/OMP-scFv-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃4 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。純化回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-OMPscFv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并隨機(jī)挑選9 株單菌落進(jìn)行PCR 鑒定和測(cè)序分析。將測(cè)序鑒定正確的重組菌株接種于含有氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃180 r/min 震蕩培養(yǎng)至OD600nm0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)5 h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。細(xì)菌經(jīng)超聲波破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 歐洲鰻鱺VH、VL 及scFv 基因的PCR 擴(kuò)增以歐洲鰻鱺脾臟cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得歐洲鰻鱺抗體VH、VL 基因，通過SOE-PCR 將VH、VL拼接為完整的scFv 基因序列。結(jié)果顯示，抗體VH、VL基因大小約為400 bp，scFv大小約為700 bp，均與預(yù)期大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示歐洲鰻鱺scFv蛋白質(zhì)編碼序列正確，呈VH-Linker-VL 結(jié)構(gòu)。表明歐洲鰻鱺scFv 基因擴(kuò)增正確。

圖1 歐洲鰻鱺抗體VH、VL 及scFv 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplifications of Anguilla anguilla VH,VL and scFv genes

2.2 噬菌體scFv 庫容測(cè)定 取3 個(gè)重復(fù)平板中噬菌斑數(shù)量的平均值，通過公式：滴度（pfu/mL）=對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，計(jì)算噬菌體scFv 庫滴度。結(jié)果顯示原始噬菌體scFv 庫滴度為42×104×10=4.2×106pfu/mL，庫容為4.2×106pfu/mL×0.3 mL=1.26×106pfu（圖2A）；擴(kuò)增后得到初級(jí)噬菌體scFv 庫滴度為2.8×109pfu/mL（圖2B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證原始噬菌體庫中scFv 基因序列的插入情況，從原始噬菌體scFv 庫的平板中隨機(jī)挑取10 個(gè)噬菌斑，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示10 個(gè)噬菌斑均擴(kuò)增出約750 bp 的scFv 基因序列（圖3）。表明scFv 基因序列同T7 Select10-3b 噬菌體載體的連接效率高，噬菌體scFv 庫已構(gòu)建。

圖2 噬菌體scFv 庫稀釋后形成的噬菌斑Fig.2 Plaques formed after dilution of the phage scFv library

圖3 隨機(jī)10 個(gè)原始噬菌體scFv 庫噬菌斑的PCR 鑒定Fig.3 Identification of phage scFv library's 10 random plaque by PCR

2.3 特異性scFv 的淘選 以嗜水氣單胞菌OMP 作為抗原，對(duì)噬菌體scFv 庫進(jìn)行4 次生物淘洗。結(jié)果顯示，經(jīng)4 次生物淘洗后仍有較多的噬菌斑產(chǎn)生（圖4），表明通過淘選獲得了含有特異性scFv 的噬菌體。

圖4 生物淘洗中的噬菌體擴(kuò)增Fig.4 Phage amplification in biopanning

2.4 特異性scFv 的阻斷ELISA 檢測(cè)結(jié)果 利用阻斷ELISA 檢測(cè)scFv 特異性，結(jié)果顯示，隨機(jī)挑取的10 個(gè)特異性噬菌體scFv 的抑制率最高達(dá)81.7%，最低為68.2%（表2）。表明淘選獲得的scFv 具有較強(qiáng)的特異性，同時(shí)具有高親和力。

2.5 pGEX-4T-2-OMP-scFv 的鑒定及原核表達(dá)結(jié)果 將pGEX-4T-2-OMP-scFv 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，隨機(jī)挑選9 株重組菌進(jìn)行PCR 檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，9 株菌株均擴(kuò)增得到約750 bp 的scFv 目的片段（圖5）。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-OMPscFv 構(gòu)建正確。

表2 阻斷ELISA 檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of blocking ELISA test

圖5 轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21 PCR 檢測(cè)Fig.5 Identification of transformed E.coli BL21 by PCR

將pGEX-4T-2-OMP-scFv/BL21 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組菌在53 ku 處表達(dá)出明顯的蛋白條帶（圖6），與預(yù)期大小一致。表明歐洲鰻鱺嗜水氣單胞菌OMP scFv 在大腸桿菌BL21 中可以高效表達(dá)。

圖6 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE results of IPTG induced expression

3 討 論

scFv 作為繼單克隆抗體之后的第3 代基因工程抗體，具有分子量小，穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，同多克隆抗體相比特異性、多樣性和定向性更高，易于大規(guī)模生產(chǎn)。在靶向治療、影像診斷和生物檢測(cè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[11]。

噬菌體展示技術(shù)是將插入到單鏈絲狀噬菌體外殼蛋白基因中的抗體可變區(qū)基因以融合蛋白形式表達(dá)呈現(xiàn)于噬菌體表面，可通過與相應(yīng)靶抗原“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集過程從抗體庫中快速高效地淘選到特異性抗體，是scFv 體外生成的重要途徑之一[9]。目前，噬菌體抗體庫在人類、家畜及家禽的病害防治與檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)魚類的噬菌體抗體庫僅在斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中有所報(bào)道[12]。

高滴度的噬菌體抗體庫是淘選特異性scFv 的基礎(chǔ)，目前已有學(xué)者在斑點(diǎn)叉尾鮰[12]和小鼠[13]中構(gòu)建了噬菌體天然抗體庫，其抗體庫滴度分別為5.67×107pfu/mL、1.2×109pfu/mL。本研究構(gòu)建的歐洲鰻鱺噬菌體天然抗體庫滴度為2.8×109pfu/mL，滴度相對(duì)較高，為淘選針對(duì)不同鰻鱺病原微生物的特異性scFv 奠定了基礎(chǔ)。

scFv 中用于VH、VL 連接的Linker 序列對(duì)于其表達(dá)水平、親和力和穩(wěn)定性至關(guān)重要，既要避免對(duì)VH、VL 折疊和結(jié)合的干擾，也不能降低scFv 的抗原識(shí)別能力。目前，15 肽（Gly4Ser）3Linker 已被廣泛應(yīng)用于scFv 的制備，其所含的甘氨酸（Gly）是分子量最小、側(cè)鏈最短的氨基酸，其空間位阻低的特點(diǎn)促進(jìn)了scFv 空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而極性較強(qiáng)的絲氨酸（Ser），有助于增加scFv 的親水性[14]。本研究采用（Gly4Ser）3的Linker 序列，以“VH-Linker-VL”的連接方式制備了歐洲鰻鱺噬菌體scFv 庫，并通過抗原-抗體特異性結(jié)合的方式成功淘選到特異性較高的scFv，表明通過本研究選擇的（Gly4Ser）3序列和scFv連接方式所獲得的scFv 具有良好的親和力和穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)[15]。

嗜水氣單胞菌是鰻鱺養(yǎng)殖中主要的病原菌之一，而OMP 作為革蘭氏陰性細(xì)菌表面主要保護(hù)性抗原分子，具有良好的免疫原性，能夠刺激宿主進(jìn)行細(xì)胞免疫和體液免疫[2，16]，因此通過鰻鱺嗜水氣單胞菌OMP 對(duì)噬菌體scFv 庫進(jìn)行淘選獲得特異性scFv，對(duì)于養(yǎng)殖鰻鱺的病害防治與檢測(cè)具有重大意義。對(duì)于特異性scFv 的淘選，目前的主要方法有固相淘選和液相淘選兩種，其中固相淘選以其操作簡(jiǎn)單易行，獲得scFv 特異性更高的特點(diǎn)，在噬菌體scFv 庫的淘選中被廣泛應(yīng)用[10]。此外，已有的研究表明淘選特異性scFv 的最佳生物淘選次數(shù)為3～4 輪，過多次數(shù)的淘選可能導(dǎo)致特異性scFv 的減少[17]。本研究采用固相淘選方式，對(duì)構(gòu)建的噬菌體scFv 庫進(jìn)行了4 輪生物淘洗，從多個(gè)噬菌斑中隨機(jī)挑取的10 個(gè)均具有較高特異性，表明該淘洗方法簡(jiǎn)單可行。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有繁殖快、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有良好的成本效益和擴(kuò)展性。本研究實(shí)現(xiàn)了高特異性的歐洲鰻鱺嗜水氣單胞菌scFv 在大腸桿菌BL21 中的高效表達(dá)，有利于后續(xù)性魚源基因工程抗體的大量制備，為基因工程抗體制劑應(yīng)用于鰻鱺病害的免疫防治與病原菌ELISA 檢測(cè)試劑盒等的研制奠定了基礎(chǔ)。