多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病免疫表型與預(yù)后分析*

張 霞，付笑迎，覃文琪，李濟(jì)填，周 杰，劉新剛△

(1.深圳大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000；2.廣東省深圳市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518055)

急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)發(fā)病率約占急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的85%，是兒童最常見的腫瘤[1-2]。B-ALL惡性腫瘤細(xì)胞抗原的表達(dá)具有高度異質(zhì)性，其診斷依賴于白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)。近年來，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)已廣泛用于LAIP檢測，為B-ALL的診斷、分型及微小殘留病灶(MRD)的監(jiān)測提供了有力的幫助[3-4]，而LAIP的存在是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測MRD的基礎(chǔ)[5]。本研究分析了兒童B-ALL免疫表型特點(diǎn)，結(jié)合患兒預(yù)后，探討了免疫表型在不同預(yù)后中的差異，有助于預(yù)測疾病和指導(dǎo)臨床個體化治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2017年12月在深圳市兒童醫(yī)院診斷及治療的B-ALL患兒120例為研究對象，其中男69例，女51例，年齡2～4歲。所有患兒均依據(jù)MICM分型標(biāo)準(zhǔn)明確診斷為B-ALL。其中細(xì)胞遺傳學(xué)異常患兒45例，包括TEL-AML1融合基因27例，E2A-PBX1融合基因7例，BCR-ABL融合基因6例，MLL-AF4融合基因2例，MLL-AF10融合基因1例，MLL-ENL 融合基因1例，TLS-ERG融合基因1例。依據(jù)CCLG-ALL-2008化療方案MICM危險度分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行危險度分級，其中低危15例，中危78例，高危27例。本研究經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均知情同意(法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書)。

1.2多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測 采用肝素抗凝管抽取患兒2～4 mL骨髓標(biāo)本，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測。骨髓標(biāo)本通過細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取(1～2)×105個有核細(xì)胞于流式測定管中。所用的熒光抗體標(biāo)記物包括BD Horizon V500、異硫氰酸熒光素(FITC)、別藻青蛋白(APC)、藻紅蛋白(PE)、多甲藻黃素葉綠素蛋白復(fù)合物(PerCP)、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7、BD Horizon V450。單克隆抗體包括CD45、淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗體(CD19、CD10、CD20、CD22、CD9、CyCD79a、CD58、SmIgM、CyIgM、TdT、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8)、髓系和干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗體(CD13、CD64、CD14、CD15、CD33、CD117、CD66c、CD11b、CD34、CD38、HLA-DR、CD123、cMPO)及同型對照IgG等。以上抗體購自美國Becton Dickinson公司及Beckman Coulter公司。流式管中加入抗凝標(biāo)本后根據(jù)試劑說明書加入抗體，充分混勻后，室溫(18～25 ℃)下避光孵育15 min；加入溶血素充分混勻，避光放置10 min，1 300 r/min離心5 min，棄去上清液；加入磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，以300×g離心5 min，棄去上清液；加入500 μL PBS混勻后用FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞分析儀(美國Becton Dickinson公司)進(jìn)行檢測。采用FACSDiva Version7.0軟件進(jìn)行標(biāo)本分析。初診時免疫分型至少記錄1×104個有核細(xì)胞。胞漿或胞核抗原表達(dá)陽性率≥10%為陽性，其他抗原表達(dá)陽性率≥20%為陽性。

1.3ALL免疫表型判斷標(biāo)準(zhǔn) 參考2016年版世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴組織腫瘤分類，B-ALL判斷標(biāo)準(zhǔn)：CD19+和(或)CyCD79a+、CD22+；急性T淋巴細(xì)胞白血病判斷標(biāo)準(zhǔn)：CD7+、CD2+/-、CyCD3+、CD3+/-。B-ALL按免疫表型又分為早前B-ALL(CD19+、CD10-、CD34+、CyIgM-、SmIgM-)、普通B-ALL(CD19+、CD10+、CD34+、CyIgM-、SmIgM-)、前B-ALL(CD19+、CD10+/-、CD34-、CyIgM+、SmIgM-)和成熟B-ALL(CD19+、CD10+/-、CD34-、SmIgM+)。

1.4治療方案 所有患兒均采用CCLG-ALL-2008化療方案進(jìn)行治療。根據(jù)不同危險度分級予以相對應(yīng)的強(qiáng)度方案及藥物劑量。具體包括，(1)誘導(dǎo)緩解治療：VDLD方案；(2)早期強(qiáng)化治療：CAM 方案；(3)鞏固治療：低、中危使用HD-氨甲蝶呤(MTX)+6-MP方案，高危使用HR-1、HR-2、HR-3方案；(4)延遲強(qiáng)化治療：VDLD、CAM方案；(5)維持治療：6-MP+MTX等。定期鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。于化療后第15天、第33天、第12周分別進(jìn)行骨髓、外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MRD檢測。

1.5療效評價標(biāo)準(zhǔn) 療程結(jié)束后，所有患兒隨訪至2018年6月，然后根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行療效評價，完全緩解(CR)：骨髓中幼稚淋巴細(xì)胞比例<5%；部分緩解(PR)：骨髓中幼稚淋巴細(xì)胞比例為5%～<25%；未緩解(NR)：骨髓中幼稚淋巴細(xì)胞比例≥25%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1B-ALL各亞型分類結(jié)果 患兒初診時根據(jù)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)所檢測的免疫表型進(jìn)行亞型分類，在120例B-ALL患兒中，早前B-ALL 5例(4.2%)，普通B-ALL 75例(62.5%)，前B-ALL 35例(29.2%)，成熟B-ALL 5例(4.2%)。

2.2淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗原在不同B-ALL亞型患兒中的陽性率 120例B-ALL患兒中，CD19陽性率最高，為100.0%，其他淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗原主要為CD10、TdT、CyCD79a、CD9、CD22、CD58，陽性率依次為95.8%、94.2%、91.7%、81.7%、80.8%、64.2%。1例早前B-ALL和1例普通B-ALL患兒CD2、CD7表達(dá)陽性，其他亞型均未見T淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗原表達(dá)。不同B-ALL亞型患兒CD22、CD9、CyCD79a、TdT陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD58陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中普通B-ALL CD58陽性率最高(72.0%)。CD20只表達(dá)于普通B-ALL和前B-ALL，在早前B-ALL和成熟B-ALL中不表達(dá)；5例成熟B-ALL表達(dá)SmIgM。見表1。

2.3髓系和干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原在不同B-ALL亞型患兒中的陽性率 120例B-ALL患兒中，有87例(72.5%)患兒表達(dá)髓系相關(guān)抗原，陽性率由高到低依次為CD33(59.2%)、CD66c(40.8%)、CD13(30.0%)、CD15(6.7%)；B-ALL中均未見髓系相關(guān)抗原CD117、CD14表達(dá)。早前B-ALL、普通B-ALL、前B-ALL和成熟B-ALL髓系相關(guān)抗原陽性率分別為80.0%(4/5)、78.7%(59/75)、57.1%(20/35)、80.0%(4/5)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原CD34、CD38、HLA-DR、CD123、CD64在B-ALL中表達(dá)，其陽性率分別為79.2%、90.0%、99.2%、60.0%、0.8%；CD34的表達(dá)最常見于早前B-ALL(100.0%)和普通B-ALL(85.3%)。不同B-ALL亞型患兒干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗原在不同B-ALL亞型患兒中的陽性率[n(%)]

表2 髓系和干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原在不同B-ALL亞型患兒中的陽性率[n(%)]

續(xù)表2 髓系和干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原在不同B-ALL亞型患兒中的陽性率[n(%)]

2.4免疫表型與預(yù)后的關(guān)系 對120例B-ALL患兒的隨訪資料分析顯示，CR患兒85例，NR患兒35例，無PR患兒。不同B-ALL亞型患兒療效比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。B-ALL髓系相關(guān)抗原陽性患兒CR率為65.5%，低于髓系相關(guān)抗原陰性患兒(84.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。CD34陽性患兒CR率為65.3%，低于CD34陰性患兒(92.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表3 不同B-ALL亞型患兒療效比較[n(%)]

表4 髓系相關(guān)抗原陽性與陰性B-ALL患兒療效比較[n(%)]

表5 CD34陽性與陰性B-ALL患兒療效比較[n(%)]

3 討 論

血液病的診斷依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)，即MICM分型。流式細(xì)胞術(shù)因具有快捷、靈敏、定量和應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，已成為白血病免疫表型和MRD檢測的主要方法之一。ALL是兒童惡性腫瘤中最常見的類型，隨著白血病診斷技術(shù)的不斷提高及化療方案的改進(jìn)，如今ALL患兒的5年無事件生存率可達(dá)90%[6-7]。兒童ALL療效的顯著提高主要依賴于個體化治療，尤其是根據(jù)危險度分級和早期調(diào)整化療方案[8]。特殊免疫表型與臨床預(yù)后相關(guān)，采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測ALL免疫表型，結(jié)合臨床預(yù)后，可為臨床危險度分級提供依據(jù)[9]。

本研究120例B-ALL患兒中，危險度分級中?；純?8例，所占比例最高(65.0%)，這與代慶凱等[10]的研究結(jié)果一致。在不同B-ALL亞型中，普通B-ALL患兒占比最高(62.5%)，其次為前B-ALL(29.2%)。B-ALL患兒細(xì)胞遺傳學(xué)異常以TEL-AML1融合基因(27例)最為常見，其次為E2A-PBX1和BCR-ABL融合基因，分別為7例和6例，這與徐一卓等[11]的研究結(jié)果一致。本研究所有B-ALL患兒均表達(dá)CD19，其他淋巴細(xì)胞系抗原CD10(95.8%)、TdT(94.2%)、CyCD79a(91.7%)、CD9(81.7%)、CD22(80.8%)的陽性率也均較高，與趙雪飛等[12]的報(bào)道一致。本研究顯示，CD58在不同亞型B-ALL間的陽性率存在差異，在普通B-ALL中陽性率最高(72.0%)。CD58作為淋巴細(xì)胞系相關(guān)功能抗原，其表達(dá)差異可能與B淋巴細(xì)胞系前體細(xì)胞發(fā)育過程中CD58分子出現(xiàn)的早晚有關(guān)。120例B-ALL患兒均未見CD3、CD4、CD5、CD8抗原表達(dá)，僅1例早前B-ALL和1例普通B-ALL患兒表達(dá)CD2、CD7，這與王曉雪等[13]的研究結(jié)果基本一致。B-ALL患兒表達(dá)T淋巴細(xì)胞系相關(guān)抗原是否與臨床預(yù)后相關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

一般認(rèn)為伴髓系相關(guān)抗原表達(dá)的ALL起源于比淋巴細(xì)胞系定向干/祖細(xì)胞更原始的干細(xì)胞。本研究顯示，120例B-ALL患兒髓系相關(guān)抗原陽性率為72.5%，其中CD33陽性最為常見，其次為CD66c、CD13、CD15，與馬瓊等[14]的報(bào)道一致，與楊碩等[9]的報(bào)道不一致，這可能與使用的單克隆抗體、陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)及研究方法不同有關(guān)。不同B-ALL亞型間髓系相關(guān)抗原陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與髓系相關(guān)抗原作為LAIP在B淋巴細(xì)胞系前體細(xì)胞發(fā)育過程中本身不表達(dá)有關(guān)。本研究干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原CD34、CD38、HLA-DR、CD123在B-ALL中的陽性率也較高，與陳敬潮等[15]的報(bào)道一致。不同B-ALL亞型干/祖細(xì)胞系相關(guān)抗原陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與ALL由共同的淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞克隆性擴(kuò)增及白血病細(xì)胞相關(guān)抗原的表達(dá)異質(zhì)性相關(guān)。

本研究對120例患兒的隨訪數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同B-ALL亞型患兒療效比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示存在于不同B-ALL亞型間的免疫表型差異與疾病預(yù)后無關(guān)。代慶凱等[10]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時MRD的免疫表型可能與初發(fā)白血病時的免疫表型有差異，但這種抗原表達(dá)的改變與預(yù)后無關(guān)，而可能與治療過程中動態(tài)監(jiān)測MRD，并進(jìn)行危險度評估，及時調(diào)整治療方案有關(guān)，本研究結(jié)果也存這種可能。有學(xué)者認(rèn)為，髓系相關(guān)抗原陽性的ALL預(yù)后差，然而目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為髓系相關(guān)抗原的表達(dá)與疾病預(yù)后無關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，髓系相關(guān)抗原陽性和陰性的B-ALL 患兒CR率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與大多數(shù)研究結(jié)果不符，可能與分析的樣本量及化療方案的不同導(dǎo)致的研究結(jié)果差異有關(guān)。CD34是造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，既往研究指出，在白血病患者中CD34陽性率高于90%，尤其是在髓系白血病M1和M2型中，但在M3型等較為成熟的白血病細(xì)胞中陽性率較低，因此推測CD34表達(dá)與白血病低分化型有關(guān)[17]。據(jù)報(bào)道，ALL患者中，CD34陽性白血病細(xì)胞與CD34陰性白血病細(xì)胞相比，更不易凋亡，本研究CD34陰性患兒較CD34陽性患兒療效更佳，可能與CD34陽性白血病細(xì)胞分化程度更低，細(xì)胞更不易凋亡有關(guān)。

4 結(jié) 論

B-ALL各亞型間免疫表型存在差異，分析B-ALL患兒免疫表型特點(diǎn)并進(jìn)行預(yù)后評估，有助于預(yù)測特殊性的免疫表型在B-ALL預(yù)后中的意義，為B-ALL患兒的危險度分級及個體化治療提供依據(jù)。