龍膽瀉肝湯對(duì)人HaCaT細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的調(diào)控研究

孫淑娜，魏海峰，許博涵，楊冠群，周煜，周曙杰，梁晨希，吳國境，張曉杰

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；3.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014）

龍膽瀉肝湯源自《醫(yī)方集解》，是臨床中常用方劑之一[1]。原方由龍膽草、梔子、黃芩、澤瀉、木通等十味藥物組成，龍膽草為君，梔子、黃芩為臣，其余為佐，諸藥同行，共奏清瀉肝膽實(shí)火、清利肝經(jīng)濕熱的功效。近年來，該方廣泛用于臨床實(shí)踐，對(duì)銀屑病也展現(xiàn)出較好的療效[2]，但其作用的分子機(jī)制尚不清楚。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖異常是銀屑病皮損處病理特征之一[3]。本研究利用人永生化表皮細(xì)胞HaCaT，分析了龍膽瀉肝湯對(duì)表皮形成細(xì)胞凋亡的影響以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人永生化表皮細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞株購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 龍膽瀉肝湯：龍膽草6g、黃芩9g、山梔 9 g、澤瀉 12 g、車前子 9 g、生地黃 20 g、當(dāng)歸8 g、柴胡10 g和甘草6 g。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶與胎牛血清：Gibco公司。Western blot用一抗：CST公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗：Abcam公司。STAT3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司，內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒：Promega公司，Lipofectamine 2000：Thermo Fisher公司，RIPA裂解液與細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol：Thermo Fisher公司。cNDA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技有限公司。Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司，雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒，Promega公司。PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜（蘇凈安泰，型號(hào)：BSC-1600IIA2）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo，型號(hào)：3111）、倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號(hào)：CKX53）、實(shí)時(shí)定量PCR儀（ROCHE，型號(hào)：LightCycler480Ⅱ）超低溫冰箱（Thermo，型號(hào)：702）、微孔板發(fā)光檢測儀（Berthold，型號(hào)：LB960）低溫高速離心機(jī)（Thermo）、電子天平：Startorius公司，型號(hào)：BSA2202S）

1.2 方法

1.2.1 龍膽瀉肝湯藥液制備 取龍膽瀉肝湯中藥成分加相當(dāng)于藥材量10倍體積的去離子水浸泡2 h，回流提取1 h并過濾，藥渣再加10倍量去離子水繼續(xù)提取1 h，合并2次濾液，濃縮定容至每mL相當(dāng)于1 g的原中藥材的藥液，離心去渣，過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞培養(yǎng)時(shí)稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2貼壁培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞融合約90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入適量胰酶，37℃放置5 min，吸掉胰酶，加入相當(dāng)2倍體積胰酶的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，800轉(zhuǎn)/min，離心3 min，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸后以1∶3的比例接種到新培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)時(shí)取狀態(tài)較好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞鋪到96孔板中，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到約90%。參照說明，分別加入適量無血清無抗生素的培養(yǎng)基，Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒混合物（STAT3質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒9∶1混合）混勻，室溫放置10 min。將配制好的Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)?；旌衔铮⊿TAT3質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒9∶1混合）加入到細(xì)胞生長的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。

1.2.4 雙熒光素酶活性測定 按照Promega公司提供的雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)說明書進(jìn)行操作。吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞1次，每孔加入被動(dòng)裂解液（PLB）細(xì)胞裂解液 20 μL，反復(fù)吹打，冰上放置10 min，再吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，通過生微孔板發(fā)光檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶活性測定。以螢火蟲熒光素酶的活性與海腎熒光素酶活性的比值表示被檢測的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的實(shí)際熒光素酶的相對(duì)活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白提取 將藥物處理的HaCaT細(xì)胞吸除培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次；細(xì)胞刮刷刮瓶底細(xì)胞，然后用移液器將細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4℃、5 000轉(zhuǎn)/min、離心 5 min，棄上清，使用RIPA裂解液冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白。

1.2.6 核蛋白的提取 細(xì)胞核蛋白的提取參照說明書。主要步驟為收取細(xì)胞沉淀，按10倍體積細(xì)胞沉淀量加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。最高速劇烈旋渦震蕩5 s，冰浴10 min，加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B，最高速劇烈旋渦震蕩5 s，4℃、12 000轉(zhuǎn)/min、離心5 min，上清至1個(gè)預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。向細(xì)胞沉淀加入細(xì)胞核蛋白抽提試劑B，最高速劇烈旋渦震蕩30 s，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高劇烈旋渦震蕩30 s，共30 min。12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，上清即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。

1.2.7 Western blot 根據(jù)所測蛋白濃度，取40 μg樣品變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉 1 h，一抗（稀釋度為 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液（TBST）洗膜，二抗（稀釋度為 1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光（ECL）化學(xué)發(fā)光，顯影定影，膠片曝光。曝光結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行光密度掃描和定量分析。

1.2.8 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用Trizol法裂解提取RNA并參照說明書逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR檢測，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每10 μL反應(yīng)體系包括去離子水4.2 μL、cDNA 模板 0.5 μL、SYBR Green I Master Mix 5 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物（上下游各 5 μmol/L）0.3 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72度延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Roche LightCycler 480自帶分析程序基因的表達(dá)。引物序列 qGAPDH-F：5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3’，qGAPDH-R：5’GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’；qSTAT3-F：5’-CAGCAGCTTGACA-CACGGTA-3’，qSTAT3-R：5’-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理。統(tǒng)計(jì)資料使用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)應(yīng)用t檢驗(yàn)分析評(píng)價(jià)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞STAT3總蛋白以及磷酸化蛋白表達(dá) 為了明確龍膽瀉肝湯對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3通路的影響，筆者首先利用Western blot檢測了龍膽瀉肝湯處理后HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3的表達(dá)。龍膽瀉肝湯處理HaCaT細(xì)胞48 h后，提取總蛋白檢測。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，龍膽瀉肝湯處理后細(xì)胞內(nèi)活性STAT3的標(biāo)志-Try705磷酸化STAT3的水平有明顯降低，同時(shí)總STAT3蛋白量也下降，且Try-705和總STAT3蛋白下降的程度隨龍膽瀉肝湯濃度的增加而增加，顯示龍膽瀉肝湯可以抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)STAT3的表達(dá)，且抑制作用呈濃度依賴性，見圖1。

圖1 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)總蛋白水平以及磷酸化STAT3水平的表達(dá)

2.2 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白的入核 STAT3磷酸化激活后，需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，激活下游靶基因的表達(dá)。為了明確龍膽瀉肝湯是否能夠抑制STAT3在細(xì)胞核內(nèi)的含量，筆者提取了龍膽瀉肝湯處理HaCaT細(xì)胞的核蛋白進(jìn)行Western blot。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，龍膽瀉肝湯處理48 h的細(xì)胞核內(nèi)STAT3表達(dá)顯著降低，提示龍膽瀉肝湯可以抑制STAT3在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，見圖2。

圖2 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞核內(nèi)STAT3的表達(dá)

2.3 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3的轉(zhuǎn)錄活性 隨后筆者又將啟動(dòng)子含有STAT3結(jié)合原件的熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析龍膽瀉肝湯對(duì)STAT3轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示與預(yù)期相符。與對(duì)照組相比，龍膽瀉肝湯處理組細(xì)胞內(nèi)STAT3報(bào)告載體的熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示龍膽瀉肝湯可以抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3轉(zhuǎn)錄活性，見圖3。

2.4 龍膽瀉肝湯對(duì)STAT3 mRNA表達(dá)的影響 利用實(shí)時(shí)定量PCR，筆者分析了龍膽瀉肝湯對(duì)STAT3 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，龍膽瀉肝湯處理后48 h，HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT3 mRNA的有略微的升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.35），見圖4。

圖3 龍膽瀉肝湯對(duì)STAT3轉(zhuǎn)錄活性的影響

圖4 龍膽瀉肝湯對(duì)STAT3 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

銀屑病的發(fā)病是在遺傳和環(huán)境的共同作用下，體內(nèi)的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和生物化學(xué)物質(zhì)功能紊亂，由異常分化增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞相互作用導(dǎo)致的免疫相關(guān)性疾病[4-6]。在銀屑病發(fā)生和發(fā)展階段，角質(zhì)形成細(xì)胞既是細(xì)胞因子作用的重要靶細(xì)胞，又是細(xì)胞因子產(chǎn)生的重要細(xì)胞[7]。皮損處浸潤的活性T細(xì)胞能夠產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-17以及IL-22等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)KC異常增殖和分化；同時(shí)，激活的角質(zhì)形成細(xì)胞又會(huì)分泌IL-1b，IL-6、IL-8、TNF-α、趨化因子（CXCL）1 等細(xì)胞因子、趨化因子以及抗菌肽，進(jìn)一步招募T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞遷移到炎性反應(yīng)部位，使炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[5-7]。所以，角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖及分化和功能異常是導(dǎo)致銀屑病重要的原因之一，亦是銀屑病治療的重要靶點(diǎn)。

龍膽瀉肝湯裁自《太平惠民和劑局方》，有瀉肝膽實(shí)火，清下焦?jié)駸嶂π?。該方?duì)銀屑病也展現(xiàn)出較好的療效[2]。筆者之前的研究顯示龍膽瀉肝湯能夠抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1期停滯和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致Cyclin D1和磷酸化RB蛋白表達(dá)下降。本研究顯示龍膽瀉肝湯能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)STAT3的轉(zhuǎn)錄活性。Cyclin D1是STAT3的轉(zhuǎn)錄底物之一。筆者之前發(fā)現(xiàn)龍膽瀉肝湯可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。因此本研究提示龍膽瀉肝湯可能通過抑制STAT3通路，調(diào)控Cyclin D1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)并進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。

STAT信號(hào)通路在包括細(xì)胞增殖，分化以及功能維持等多個(gè)生物學(xué)過程中均發(fā)揮著重要的功能，其異?？蓪?dǎo)致包括腫瘤和自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生。炎性因子如IL-22，IL-23通過結(jié)合并激活相應(yīng)細(xì)胞膜受體，進(jìn)而磷酸化并激活酪氨酸激酶蛋白（JAK）。激活的JAK可以發(fā)揮激酶功能，進(jìn)一步磷酸化并激活STAT蛋白，導(dǎo)致后者形成同源或異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)DNA元件結(jié)合，激活下游基因的表達(dá)[8]。STAT家族共包括7個(gè)成員，其中STAT3主要參與體內(nèi)Th17細(xì)胞反應(yīng)[9]。鑒于Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的關(guān)鍵作用[10-11]，因此STAT3被認(rèn)為與銀屑病發(fā)病最為密切。研究顯示銀屑病患者皮損處無論是總蛋白水平還是磷酸化STAT3水平都要顯著高于正常皮膚，并且角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)活性STAT3可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)典型銀屑病樣病征[12-13]。STAT3通路是治療銀屑病的重要靶點(diǎn)之一，目前針對(duì)此通路的藥物在前期臨床試驗(yàn)中也展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用前景[9，14-15]。因此筆者的研究提示STAT3是龍膽瀉肝湯治療銀屑病的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，龍膽瀉肝湯通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)STAT3通路的活性發(fā)揮銀屑病治療的功效。

本研究還發(fā)現(xiàn)，龍膽瀉肝湯可顯著抑制STAT3的總量。那么龍膽瀉肝湯是否是通過抑制STAT3總蛋白的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)其對(duì)功能的抑制？除了對(duì)蛋白表達(dá)的調(diào)控，龍膽瀉肝湯是否也直接影響STAT3的磷酸化過程？其具體機(jī)制如何？此外，與靶向藥物相比，中藥成分復(fù)雜，其作用呈現(xiàn)出多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，較單一作用靶點(diǎn)的藥物相比有低毒、高效的優(yōu)勢。那么除了STAT3，角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)是否還存在其他龍膽瀉肝湯的作用靶點(diǎn)？這些問題還有待醫(yī)者們進(jìn)一步探討。