幾種茶對(duì)大鼠草酸鈣結(jié)石的影響

羅千旋，劉云龍，劉權(quán)，李德榮，孫焱，康玨寧，鄧耀良

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科,廣西 南寧)

0 引言

茶是世界上最受歡迎的飲料之一，按照制造工藝可簡單分為兩種：不發(fā)酵茶和發(fā)酵茶；發(fā)酵茶按發(fā)酵的形式又可以分為前發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶。不發(fā)酵茶葉即綠茶，以采摘適宜茶樹新梢為原料，不經(jīng)發(fā)酵。發(fā)酵茶是指在茶葉制作中有“發(fā)酵”這一工序的茶的統(tǒng)稱。發(fā)酵按其發(fā)酵過程中有沒有微生物的參與可分為前發(fā)酵和后發(fā)酵。前發(fā)酵是茶葉自身的內(nèi)源性酶促發(fā)酵，后發(fā)酵茶則需要微生物參與發(fā)酵，不同的茶種其參與發(fā)酵的微生物不同，產(chǎn)生的活性物質(zhì)也不盡相同。后發(fā)酵茶為黑茶，其發(fā)酵程度達(dá)100%。前發(fā)酵茶按發(fā)酵程度的高低可分為黃茶（微發(fā)酵，10%-20%）、白茶（輕發(fā)酵，20%-30%）、青茶（半發(fā)酵，30%-60%）、紅茶（全發(fā)酵，80%-90%）。發(fā)酵程度不同，茶葉中的活性成分含量也不一樣。

泌尿系統(tǒng)結(jié)石形成的相關(guān)因素有多種，環(huán)境因素具有重要的作用，工業(yè)化、生活方式的改變、飲食習(xí)慣的變化使得泌尿系統(tǒng)結(jié)石呈增加趨勢(shì)。不健康的生活方式是一般人群患病的主要原因，合理健康的行為可防止疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，我們通過飲食方面對(duì)腎結(jié)石患者的健康行為進(jìn)行研究。以往的研究發(fā)現(xiàn)茶葉的提取物茶多酚可以抑制尿路結(jié)石的形成[1,2]，而茶葉本身含有可溶性草酸鹽且不同類別茶葉中的茶多酚含量也存在差異，茶是否可以被結(jié)石患者很好的飲用尚存在爭(zhēng)議。為此，我們選擇不發(fā)酵的綠茶、半發(fā)酵的烏龍茶、后發(fā)酵但菌群不同的普洱茶和六堡茶，四者的活性成分差異明顯，我們?cè)囍ㄟ^對(duì)比這四種茶葉對(duì)尿路結(jié)石形成的影響來進(jìn)一步探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

乙二醇（分析純）購自成都金山化學(xué)試劑有限公司，立頓牌綠茶和烏龍茶、云南普洱茶（熟茶）、廣西六堡茶均購自沃爾瑪超市，一步法TUNEL 凋亡試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，鈣鹽染色液（改良茜素紅S 法）、超氧化物歧化酶（SOD）和還原性谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 茶水的制備

2.5%的茶水通過稱取25g 茶葉加入到1L 沸水中繼續(xù)沸騰30min 制備。茶葉泡開后茶多酚等氧化物會(huì)在空氣中不斷氧化而失去作用，為達(dá)到理想真實(shí)的效果茶水必須當(dāng)天制備，這雖然很麻煩但卻是必不可少的。

1.3 動(dòng)物模型建立

所有動(dòng)物由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物的使用遵守動(dòng)物保護(hù)有關(guān)條例且各組大鼠均在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)。將36 只成年雄性大鼠（SPF 級(jí)180-200g）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分成6 組（n=6）：空白組（A 組）、結(jié)石誘導(dǎo)組（B 組）、綠茶干預(yù)組（C 組）、烏龍茶干預(yù)組（D 組）普洱茶干預(yù)組（E 組）六堡茶干預(yù)組（F組）。A 組大鼠給予正常飲食并自由飲水；B 組給予大鼠2%的乙二醇自由飲用；C、D、E、F 組給予2%乙二醇+2.5%茶水自由飲用，自由飲用不佳則采取灌胃模式。

1.4 茶水中茶多酚含量的測(cè)定

取新鮮備好的綠茶、烏龍茶、普洱茶和六堡茶四種茶水送廣西壯族自治區(qū)分析研究測(cè)試研究中心檢測(cè)茶水中茶多酚和兒茶素類含量（NO: P-WL1801273E）。

1.5 尿液肌酐、鈣離子的測(cè)定

飼養(yǎng)4 周后通過代謝籠收集大鼠24h 尿液，全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 7600，Tokyo，Japan）測(cè)量尿液肌酐、鈣離子含量。

1.6 血清中 CRE 和 BUN 的測(cè)定

在研究結(jié)束時(shí)，在乙醚麻醉下從大鼠的下腔靜脈收集血樣分離血清。使用全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 7600，Tokyo，Japan）測(cè)定血清肌酐和血尿素氮水平。

1.7 血清 SOD 和 GSH-Px 活性

嚴(yán)格按照試劑盒說明書以比色法測(cè)定大鼠血清SOD 和 GSH-Px 活性。

1.8 原位TUNEL 熒光染色試驗(yàn)

根 據(jù) 制 造 商 的 說 明 書（Roche，Mannheim，Germany），使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）測(cè)定來評(píng)估腎臟的細(xì)胞凋亡。

1.9 病理學(xué)分析

28 天后，對(duì)大鼠實(shí)施安樂死，取右腎用4%多聚甲醛固定并包埋在石蠟中。切片進(jìn)行HE 染色，根據(jù)制造商的說明使用改良茜素紅S 法來評(píng)估晶體沉積和組織學(xué)組織損傷。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20.0 軟件，數(shù)據(jù)用means±SEM 表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析 (ANNOVA)，組間兩兩比較采用 LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茶水中茶多酚的含量

四種茶水茶多酚和兒茶素類含量從高到低依次是綠茶＞烏龍茶＞普洱茶＞六堡茶（圖1）。

2.2 各組大鼠腎功能的變化

與 A 組對(duì)比，B 組血清 CRE 和 BUN 水平顯著增加；與 B 組對(duì)比，使用綠茶（C 組）、烏龍茶（D 組）、普洱茶（E 組）、六堡茶（F 組）干預(yù)后則 CRE 和 BUN 水平明顯降低，見圖2。

圖1 新鮮泡好的的綠茶，烏龍茶，普洱茶和六堡茶的茶多酚和兒茶素類含量。

圖2 各組大鼠腎功能的變化

2.3 各組大鼠血清SOD 和GSH-Px 活性

與A 組對(duì)比，B 組血清SOD 和GSH-Px 活性顯著降低；與 B 組對(duì)比，使用綠茶（C 組）、烏龍茶（D 組）、普洱茶（E 組）、六堡茶（F 組）干預(yù)后則 SOD 和 GSH-Px活性明顯提高，見圖3。

圖3 各組大鼠血清SOD和GSH-Px活性

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

評(píng)估茶對(duì)腎結(jié)石模型大鼠腎小管細(xì)胞死亡的影響。與對(duì)照組相比，結(jié)石模型組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加；而與結(jié)石模型組相比，使用綠茶（C 組）、烏龍茶（D 組）、普洱茶（E 組）、六堡茶（F 組）干預(yù)后的各組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，見圖4。

2.5 腎臟晶體沉積和組織病理學(xué)分析

用腎組織HE 染色和鈣鹽染色評(píng)估CaOx 晶體沉積和腎組織中的病理變化。如圖5，與A 組相比， B、C、D、E、F 組的腎組織有所改變，且B 組變化最明顯：腎小管管腔擴(kuò)張、空泡化,上皮細(xì)胞損傷脫落。與A 相比，B 組中CaOx 晶體形成顯著增加,從皮質(zhì)區(qū)到髓質(zhì)區(qū)都有，而使用綠茶（C 組）、烏龍茶（D 組）、普洱茶（E 組）、六堡茶（F 組）干預(yù)后的各組結(jié)石晶體明顯減少。

圖4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

圖5 腎組織HE 和鈣鹽染色（×400）

3 討論

腎結(jié)石是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病和多發(fā)病，含鈣結(jié)石最常見，總發(fā)病率為84.1%，腎內(nèi)常見的晶體主要包括CaOx 晶體、磷酸鈣晶體和尿酸鹽等成份，其中CaOx 晶體最為常見[3]高草酸飲食是形成泌尿系結(jié)石的主要原因，茶葉中含有大量的可溶性草酸鹽[4]，可以促進(jìn)腎結(jié)石的形成。

我們先前的研究表明，細(xì)胞晶體反應(yīng)誘導(dǎo)的腎臟炎癥損傷在腎內(nèi)鈣草酸鹽晶體的形成中起重要作用。暴露于高濃度草酸或草酸鈣晶體的腎小管上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生ROS，繼而啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生大量的氧自由基，最終介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致炎癥發(fā)生[5]。同時(shí)，ROS 介導(dǎo)的自噬可能加重腎損傷并促進(jìn)結(jié)石的形成[6]。線粒體通常是ROS 最常見的細(xì)胞內(nèi)來源，細(xì)胞損傷通常伴隨著ROS 的產(chǎn)生[7]。

兒茶素是綠茶中的主要多酚化合物，兒茶素具有高效的抗氧化活性，盡管在某些情況下它們可能作為促氧化劑在細(xì)胞中起作用。兒茶素類是活性氧（ROS）清除劑和金屬離子螯合劑，而它們的間接抗氧化活性包括誘導(dǎo)抗氧化酶，抑制促氧化酶，以及產(chǎn)生II 期解毒酶和抗氧化酶[8]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），表沒食子兒茶素（EGC），表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表兒茶素（EC）是從綠茶中分離的四種主要天然多酚。EGCG 是最豐富的多酚，占綠茶總兒茶素的38-40%[9,10]。EGCG 具有多種生物活性，包括抗氧化[11-13]，抗炎癥[14,15]，抗增殖[16]，抗菌[17]，抗突變和抗癌[18]、清除有毒反應(yīng)性代謝廢物[19]。已知EGCG 是線粒體靶向藥物[20-22]。由于強(qiáng)大的抗氧化作用，飲食中衍生的EGCG 可以顯著減少線粒體產(chǎn)生的ROS，從而改善心血管疾病的情況[22]。研究表明EGCG 可以抑制泌尿系結(jié)石的形成[1]。

隨著發(fā)酵過程的不斷進(jìn)展，茶葉中一些兒茶素結(jié)合形成結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的茶黃素、茶紅素、茶褐素三種茶色素和其他類黃酮，引入不同微生物發(fā)酵的后發(fā)酵茶更是額外形成了其獨(dú)特的物質(zhì)，這些成分給發(fā)酵茶添加別致風(fēng)味的同時(shí)也具備了一些特別的生物活性。研究表明茶色素具有抗氧化、抗炎、抗癌抗腫瘤、抗菌抗病毒、降血脂預(yù)防心腦血管疾病等作用[23-27]。此外普洱茶（熟）在減輕慢性炎癥改善動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展方面有所報(bào)道[28]，更有報(bào)道指出普洱茶（熟）能顯著降低高尿酸血癥小鼠得血清尿酸水平[29]。一些學(xué)者認(rèn)為茶色素由于具備了更多的活性羥基官能團(tuán)，在某些方面其藥理作用要比兒茶素活躍[30]。我們有理由相信，發(fā)酵茶和綠茶一樣在預(yù)防泌尿系腎結(jié)石方面也應(yīng)具有積極的意義。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，茶葉隨著發(fā)酵程度的加深茶多酚及兒茶素類含量相應(yīng)減少，但他們?cè)诖笫蟛菟徕}腎結(jié)石模型中效果是相似的。和結(jié)石組相比使用4種茶水干預(yù)后大鼠血清CRE 和BUN 水平明顯降低，鏡下可見腎小管損傷減輕及腎內(nèi)CaOx 晶體形成顯著減少，這表明茶在此動(dòng)物模型中具有很好的腎臟保護(hù)效果。此外，使用茶水干預(yù)后大鼠血清SOD 和CSH-Px活性明顯提高，細(xì)胞凋亡程度明顯減輕，這提示我們茶的腎臟保護(hù)效果很可能與其抗氧化作用有關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示，茶葉對(duì)大鼠泌尿系結(jié)石的形成有抑制作用，這很可能和它的抗氧化性有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)于從飲食方面預(yù)防泌尿系結(jié)石有很好的參考意義。