太子參愈傷組織與植株再生培養(yǎng)基和外植體的篩選

張 博，吳 進(jìn)，朱潔林，董云富,卜程洪*

(1.興義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 貴州 興義 562400；2.興義市南盤(pán)江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,貴州 興義 562400)

太子參又名孩兒參、童參、四葉參、米參等，為石竹科多年生草本植物異葉假繁縷的塊根，味甘、苦，性平，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺之功效[1-2]，是一種常用中藥材。隨著制藥企業(yè)以太子參為主要成分的藥品開(kāi)發(fā)不斷發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)太子參的需求量不斷增大，使引種栽培太子參的地方不斷增多。如貴州黔東南州施秉縣自1992年引種太子參后，種植規(guī)模和產(chǎn)量不斷增加，目前已成為我國(guó)太子參的主產(chǎn)區(qū)之一，太子參產(chǎn)量已達(dá)全國(guó)市場(chǎng)三分之一左右的量[3]。

太子參以塊根種植為主，較長(zhǎng)時(shí)間連作會(huì)使太子參種性退化[4]，為此，一些學(xué)者致力于太子參優(yōu)良品種的選育，以滿足當(dāng)前太子參種植的需求。利用化學(xué)誘變的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病、抗蟲(chóng)的突變體植株，再通過(guò)擴(kuò)繁及大田試驗(yàn)篩選出產(chǎn)量高、優(yōu)質(zhì)的突變體，是當(dāng)前一些學(xué)者選育太子參良種常用、有效、經(jīng)典的方式[5-6]。太子參愈傷組織、組培幼芽是進(jìn)行太子參化學(xué)誘變的基礎(chǔ)材料，因此，研究以太子參種子、種根、莖段、葉作為外植體的愈傷組織、幼苗培養(yǎng)方法，為太子參化學(xué)誘變育種提供參考具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 外植體制備

取太子參種子、種根、莖段、葉(均采自貴州省六盤(pán)水太子參種植基地)，分別用自來(lái)水洗凈，后用蒸餾水沖洗6次，再用75%乙醇浸泡30 s、0.1%升汞浸泡10 min，最后用無(wú)菌水清洗干凈。在無(wú)菌操作臺(tái)上用消毒好的解剖刀、鑷子、剪刀，挑出太子參種胚，把種根、莖段剪成5 cm的小段，把葉剪成0.5 cm×0.5 cm的小方塊，備用。

1.2 愈傷組織培養(yǎng)基篩選

以pH 5.8的MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉7.5 g/L作為基本培養(yǎng)基。分別以2-4D、6-BA、KT的不同濃度為試驗(yàn)因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。按每處理重復(fù)3次、每重復(fù)20瓶、每瓶接種3個(gè)的數(shù)量，把制備的太子參葉接種于組培瓶中。各處理前5 d在黑暗條件下培養(yǎng)，后在光照強(qiáng)度為1 500 lx、溫度為25℃的條件下培養(yǎng)，每天光照12 h。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)量，按誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷組織總數(shù)/供試葉數(shù))×100%計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率[7]。

1.3 愈傷組織外植體篩選

分別將制備的太子參種胚、種根、莖段、葉接種于(通過(guò)1.2)篩選出的最優(yōu)愈傷組織培養(yǎng)基中。每種外植體接種20瓶，每瓶接種3個(gè)，重復(fù)3次。在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為1 500 lx條件下培養(yǎng)，每天光照12 h。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)量，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 DPS 7.05和 Excel 2012進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)太子參愈傷組織培養(yǎng)基的選擇

由表1的R值分析可知，2,4-D、6-BA、KT對(duì)太子參外植體葉的愈傷組織誘導(dǎo)都有影響，其中KT對(duì)太子參葉的萌發(fā)影響最大，2,4-D次之，6-BA最??；經(jīng)方差分析與顯著性檢驗(yàn)表明，處理5(A2B2C3)的誘導(dǎo)率最高、為94.45%，且與其他處理的差異顯著或極顯著，說(shuō)明在MS培養(yǎng)基中加入4 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT的誘導(dǎo)效果最佳。

表1 愈傷組織培養(yǎng)基篩選正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：A、B、C分別表示2,4-D、6-BA、KT。

2.2 誘導(dǎo)太子參愈傷組織外植體的選擇

由表2可知，太子參不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。其中以種胚最高、為96.11%，葉次之、為94.44%，莖段稍低、為86.66%，種根不能誘導(dǎo)出愈傷組織。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，太子參種胚誘導(dǎo)的愈傷組織在培養(yǎng)1周后開(kāi)始膨大，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)慢慢增大，且相對(duì)比較緊密、其顏色呈米白色；太子參葉在培養(yǎng)1周后葉緣開(kāi)始褶皺，2周左右后可在葉緣見(jiàn)到稍有凸起的白色愈傷組織，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)慢慢變大，其顏色呈米白色、肉質(zhì)相對(duì)比較疏松；太子參莖段隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其形成的愈傷組織比較?。惶訁⒎N根隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)慢慢枯死。說(shuō)明太子參種胚、葉適合作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

表2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率

2.3 太子參植株再生培養(yǎng)基選擇

由表3可見(jiàn)，6-BA、NAA不同濃度配比的3個(gè)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織植株再生分化無(wú)差異。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)10 d左右時(shí)3個(gè)培養(yǎng)基都開(kāi)始分化出幼苗，分化率都能達(dá)到100%。但培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基誘導(dǎo)生長(zhǎng)出來(lái)的太子參幼苗長(zhǎng)勢(shì)有一定差異，以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L培養(yǎng)基幼苗相對(duì)多、壯實(shí)、綠色，認(rèn)為該培養(yǎng)基更適合太子參愈傷組織的再生培養(yǎng)。

表3 不同培養(yǎng)基的植株再生結(jié)果

3 小結(jié)與討論

1) 不同種類激素對(duì)太子參愈傷組織的誘導(dǎo)影響強(qiáng)度不同，以KT影響最大，2,4-D次之，6-BA最??；不同濃度配比對(duì)太子參愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著影響，當(dāng)培養(yǎng)基中加入4 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L 6-BA 0.5 mg/L KT時(shí)誘導(dǎo)率可達(dá)94.45%。

2) 以太子參種子、太子參葉、太子參莖段、種根作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，其誘導(dǎo)率差異顯著，種胚的誘導(dǎo)率最高可達(dá)96.11%。

3) 本試驗(yàn)中不同激素濃度配比培養(yǎng)基都能100%誘導(dǎo)太子參愈傷組織分化成幼苗，但是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)生長(zhǎng)出來(lái)的幼苗相對(duì)多且壯實(shí)。

本研究在愈傷組織培養(yǎng)基篩選中只比較了外植體葉的誘導(dǎo)率，而沒(méi)有對(duì)種胚、莖、種根等進(jìn)行比較；在愈傷組織誘導(dǎo)幼苗的培養(yǎng)基篩選中僅比較了全部愈傷組織，而沒(méi)有分別對(duì)由種胚、幼葉、莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行比較。本研究存在的不足，有待今后進(jìn)行彌補(bǔ)。