冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證血清中氨基酸代謝組學(xué)研究

楊小芳 王茹 何鵬彬

摘要 目的：利用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法研究冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證患者血清中氨基酸內(nèi)源性代謝物的變化。方法：選取2018年3月至2019年2月中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院收治的穩(wěn)定型冠心病心絞痛患者60例作為研究對(duì)象，其中包括氣滯血瘀證30例和氣虛血瘀證30例，以及對(duì)照組30例，以液相-質(zhì)譜聯(lián)用為技術(shù)平臺(tái)，通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式，檢測(cè)血清樣本中20種氨基酸含量，同時(shí)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析及差異代謝物的分析。結(jié)果：根據(jù)PLS-DA圖顯示對(duì)照組與冠心病不同證型之間氨基酸代謝輪廓明顯不同，其中冠心病組纈氨酸、組氨酸、鳥氨酸等多種氨基酸較對(duì)照組含量升高，而γ-氨基丁酸與谷氨酰胺含量降低。氣滯血瘀組和氣虛血瘀組的差異代謝物主要有組氨酸，瓜氨酸等，且2種證型中氣虛血瘀組中含量較高。結(jié)論：冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證中的氨基酸代謝機(jī)制紊亂，為區(qū)分冠心病中醫(yī)證型提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 代謝組學(xué);氨基酸;冠心病心絞痛;氣滯血瘀證;氣虛血瘀證

Abstract Objective：To study the changes of amino acid endogenous metabolites in the serum of patients with qi stagnation and blood stasis syndrome（QS），qi deficiency and blood stasis syndrome（QD）of coronary heart disease（CHD）with angina pectoris using LC-MS.Methods：A total of 60 patients with stable coronary heart disease and angina pectoris admitted to Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences from March 2018 to February 2019 were selected，including 30 patients with qi stagnation and blood stasis syndrome，30 patients with qi deficiency and blood stasis syndrome，and 30 patients in the control group.Using LC-MS as the technology platform，the multi-reaction monitoring scanning mode was used to detect the content of 20 amino acids in serum samples，and the partial least squares discriminant analysis and differential metabolite analysis were also performed.Results：According to the PLS-DA，the amino acid metabolism profile between the control group and different syndromes of CHD was completely different.The contents of valine，histidine，ornithine and other multiple amino acids in the group of patients with CHD were significantly higher than the control group，while the content of γ-aminobutyric acid and glutamine decreased.Differential metabolites mainly include histidine，citrulline，etc.in and QS and blood stasis group and QD and blood stasis group，with QD containing the more.Conclusion：The amino acid metabolism in patients with CHD and angina pectoris QS and blood stasis and QD syndrome and blood stasis was disordered which provided a scientific basis for distinguishing TCM syndromes of CHD.

Keywords Metabolomics; Amino acids; Coronary heart disease angina pectoris; Qi stagnation and blood stasis syndrome; Qi deficiency and blood stasis syndrome

據(jù)流行病學(xué)研究分析，冠心病是危害人類身體健康的主要疾病之一，其發(fā)病年齡日漸年輕化，發(fā)病率總體呈持續(xù)上升趨勢(shì)[1]?！吨袊难懿?bào)告2018》概要揭示，心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民病死的40%以上[2]。中醫(yī)在治療冠心病方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，而冠心病中醫(yī)分型又以血瘀證為多，約占70%[3]，由于各證型之間常互兼夾，臨床的辨證論治則難度較大。代謝組學(xué)研究具有整體、動(dòng)態(tài)、綜合與分析的特點(diǎn)，能夠從代謝網(wǎng)絡(luò)終端表象的整體角度反映生物體的功能水平，與中醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)觀、整體觀相近[4]。靶向代謝組學(xué)的發(fā)展使得我們更清楚的看到某一類代謝物的變化情況。內(nèi)源性小分子氨基酸與心血管疾病有重要的聯(lián)系[5]，因此本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期氨基酸靶向代謝組學(xué)的研究成果[6]，開展了穩(wěn)定型冠心病心絞痛氣滯血瘀合氣虛血瘀患者的血清中靶向20種氨基酸的定量研究，從內(nèi)源性小分子氨基酸水平上探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年2月中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院收治的穩(wěn)定型冠心病心絞痛患者60例作為研究對(duì)象。對(duì)照組經(jīng)普通體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查排除肝腎、心腦血管等疾病的健康志愿者，對(duì)照組中男17例，女13例，年齡48～75歲，平均年齡（60.3±1.0）歲;氣滯血瘀組中男16例，女14例，年齡44～75歲，平均年齡（61.9±1.4）歲;氣虛血瘀組中男16例，女14例，年齡48～74歲，平均年齡（63.3±1.3）歲。3組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。受試者于空腹抽取肘靜脈血置于真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min（離心半徑81 mm）離心10 min，取上層血清，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 1）西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考國際心臟病學(xué)會(huì)和協(xié)會(huì)及世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組報(bào)告《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]及歐洲心臟病學(xué)會(huì)2013年發(fā)布的《歐洲心臟病學(xué)會(huì)穩(wěn)定型冠狀動(dòng)脈疾病管理指南》[8]。2）中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：疾病及證型診斷參照中國中醫(yī)藥管理局制定的《2014版各科診療方案》中的“胸痹心痛病”（慢性穩(wěn)定型心絞痛）中醫(yī)診療方案。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 住院患者，年齡在40～75歲之間;經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，符合穩(wěn)定性冠心病心絞痛診斷者;中醫(yī)辨證為氣滯血瘀證、氣虛血瘀證的患者;患者自愿簽訂知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 血壓控制不良患者、嚴(yán)重糖尿病代謝綜合征患者;患有嚴(yán)重慢性心力衰竭、嚴(yán)重心律失?；虬惭b有心臟起搏器、心肌梗死病史的患者;患者有活動(dòng)性消化道潰瘍和其他出血性疾病的存在;患有惡性腫瘤，自身免疫性疾病或血液疾病患者。

1.5 研究方法

1.5.1 儀器與試劑 Waters超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國waters公司，型號(hào)：XEVO TQ-S）;乙腈及甲酸（美國fisher公司，貨號(hào)：A456-4和A113-50）;甲酸銨（美國Sigma公司，貨號(hào)：70221）;甘氨酸（貨號(hào)：G8898）、β-丙氨酸（貨號(hào)：146064）、丙氨酸（貨號(hào)：A7627）、γ-氨基丁酸（貨號(hào)：A2129）、絲氨酸（貨號(hào)：S4500）、纈氨酸（貨號(hào)：855987）、蘇氨酸（貨號(hào)：T8625）、?；撬幔ㄘ浱?hào)：T0625）、亮氨酸（貨號(hào)：L8000）、異亮氨酸（貨號(hào)：I2752）、反式-羥脯氨酸（貨號(hào)：56250）、天冬酰胺（貨號(hào)：A0884）、鳥氨酸（貨號(hào)：W419001）、賴氨酸（貨號(hào)：L5501）、甲硫氨酸（貨號(hào)：M9625）、苯丙氨酸（貨號(hào)：P1751）、1-甲基-組氨酸（貨號(hào)：67520）、瓜氨酸（貨號(hào)：C7629）、色氨酸（貨號(hào)：T0254）均購于美國sigma公司;谷氨酰胺（貨號(hào)：A0784）、組氨酸（貨號(hào)：A0698）購于日本TCI公司;氨基酸內(nèi)標(biāo)（貨號(hào)：NSK-1）購自于美國CIL（Cambridge Isotope Laboratories）公司，其中該內(nèi)標(biāo)包含11種同位素氨基酸;超純水為Milli-Q system超純水純化系統(tǒng)。

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取上述氨基酸對(duì)照品1 mg置1.5 mL的EP管中，溶解得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻放入4 ℃冰箱備用。

1.5.3 血液樣本的處理 將血清放置4 ℃冰箱解凍，振蕩混合均勻，取樣4 μL裝于1.5 mL的離心管中，然后加入991 μL提取液及5 μL內(nèi)標(biāo)液（NSK-1內(nèi)標(biāo)液稀釋50倍），渦旋混合1 min，4 ℃下12 000 r/min（r=84 mm）離心5 min，取上清液于進(jìn)樣小瓶內(nèi)待測(cè)[5]。

1.5.4 色譜條件 超高效液相色譜ACQUITY BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A：乙腈（含0.2%甲酸和1 mmol甲酸銨）;流動(dòng)相B：超純水（含0.1%甲酸和1 mmol甲酸銨）;梯度洗脫：（0.0 min，85%A;5.5 min，80%A;12.5 min，60%A;13.5 min，85%A;15 min，85%A），柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.5.5 質(zhì)譜條件 Waters三重四級(jí)桿質(zhì)譜（TQ-S）儀：采用正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行采集;毛細(xì)管電壓為0.4 KV;錐孔電壓為20 V。離子源溫度為150 ℃;去溶劑氣溫度為400 ℃;去溶劑氣流量為800 L/h;錐孔氣流量為150 L/h。各氨基酸對(duì)應(yīng)的母子離子對(duì)，錐孔電壓及碰撞能量以發(fā)表。數(shù)據(jù)分析利用MassLynx V 4.1對(duì)采集得到的譜圖進(jìn)行離子對(duì)的積分等操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將得到的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每一行代表一個(gè)樣本，每一列代表一種化合物，數(shù)值即為此化合物在樣本中的含量。以Excel形式保存，用于模式識(shí)別分析。將其Excel導(dǎo)入至SIMCA-P軟件（13.0）進(jìn)行建模判別分析，模式識(shí)別采用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。之后將測(cè)得的20種靶向氨基酸進(jìn)行方差分析（P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），找出顯著性差異的代謝差異物，從內(nèi)源性小分子氨基酸水平上探討其機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 將氨基酸類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/L）用配制的提取液稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，線性范圍見表1，在上述儀器條件下分析。各氨基酸與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，以濃度（pg/μL）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。以3倍信噪比（S/N）估算方法檢測(cè)限，以10倍信噪比（S/N）估算方法定量限，結(jié)果見表1。

2.2 氣滯血瘀證與氣虛血瘀證患者血樣氨基酸代謝組學(xué)研究 為了更清楚的表達(dá)氨基酸內(nèi)源性代謝輪廓，偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）方法能夠很好的解決無監(jiān)督分析中組間差異不明晰的問題，從PLS-DA圖（圖1）中可以看出圖中的每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，患有穩(wěn)定型心絞痛的冠心病患者的代謝狀態(tài)與對(duì)照組的代謝狀態(tài)明顯不同，冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證氨基酸代謝輪廓也存在明顯不同，再對(duì)其血樣中的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由表2可以看出，對(duì)照組，氣滯血瘀組與氣虛血瘀組患者體內(nèi)氨基酸的含量變化情況，大多數(shù)氨基酸在冠心病心絞痛患者血清中含量較高，且有顯著性差異（組氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、?；撬?、亮氨酸、纈氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-組氨酸、瓜氨酸），2種氨基酸（谷氨酰胺、γ-氨基丁酸）較對(duì)照組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。本研究根據(jù)不同證型氨基酸代謝物的變化來闡明中醫(yī)“證候”的調(diào)節(jié)機(jī)制。所有采集的數(shù)據(jù)對(duì)不同證型的代謝標(biāo)志物進(jìn)行區(qū)分，從靶標(biāo)代謝組學(xué)研究篩查出與心力衰竭相關(guān)氨基酸小分子標(biāo)志物分析研究，涉及到上述氨基酸代謝通路，說明冠心病心絞痛患者的氨基酸代謝是紊亂的，同時(shí)不同證型的氨基酸代謝通路機(jī)制上也存在一定差異。

3 討論

本研究利用LC-MS技術(shù)對(duì)冠心病氣滯血瘀證及氣虛血瘀證患者的血清樣本進(jìn)行氨基酸代謝組學(xué)分析，探索2種證型血清中20種氨基酸的代謝情況。發(fā)現(xiàn)冠心病血清樣本中組氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、?；撬帷⒘涟彼?、纈氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-組氨酸較對(duì)照組含量升高，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸較對(duì)照組降低。在心肌受損的情況下，ATP合成減少，心肌耗氧量增加。支鏈氨基酸中的亮氨酸與纈氨酸均可轉(zhuǎn)化成糖和脂質(zhì)，為機(jī)體提供能量[9]。因此，這些代謝物含量升高是為了適應(yīng)機(jī)體的應(yīng)急反應(yīng)。組氨酸可以在組氨酸脫羧酶的催化下生成組胺，過多的組胺可誘發(fā)冠脈收縮，冠脈血流減少，加重心肌缺血[10]。甲硫氨酸增加會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損、血管舒縮功能減弱，增加冠心病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[11]。甲硫氨酸通過轉(zhuǎn)硫作用生成?；撬?，牛磺酸含量顯著升高[12]。冠心病患者機(jī)體代謝發(fā)生障礙，鳥氨酸循環(huán)被激活，導(dǎo)致尿素及鳥氨酸積累。瓜氨酸是從鳥氨酸及胺基甲醯磷酸鹽在尿素循環(huán)中生成，因此鳥氨酸的增加導(dǎo)致瓜氨酸含量也顯著增加。而生糖氨基酸谷氨酰胺可通過谷氨酰胺異化轉(zhuǎn)化成糖，為機(jī)體提供能量[13]。丙氨酸升高使無氧代謝增強(qiáng)，造成ATP合成減少[14]。γ-氨基丁酸能夠擴(kuò)張血管，防止動(dòng)脈硬化等作用，冠心病患者血樣中γ-氨基丁酸含量顯著降低。甘氨酸在絲氨酸經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，由絲氨酸合成，甘氨酸含量降低[15]，提示絲氨酸合成甘氨酸的過程受到阻礙，造成絲氨酸含量的積累。2種證型之間的差異物主要為組氨酸及瓜氨酸，且氣虛血瘀證升高的更為明顯，提示冠心病心絞痛氣滯血瘀及氣虛血瘀患者機(jī)制主要相關(guān)是組氨酸和瓜氨酸的代謝通路上，為更好區(qū)別兩證型還需要進(jìn)一步的其他類別內(nèi)源性小分子的差異分析。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhao LL，Wan L，Qiu XJ，et al.A Metabonomics Profiling Study on Phlegm Syndrome and Blood-Stasis Syndrome in Coronary Heart Disease Patients Using Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：1-10.

[2]胡盛壽，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報(bào)告2018》概要[J].中國循環(huán)雜志，2019，34（3）：209-220.

[3]Li S，Zhang Z，Wu L，et al.Understanding Zheng in traditional Chinese medicine in the context of neuro-endocrine-immune network[J].IET system biology，2007，1（1）：51-60.

[4]Hu CX，Xu GW.Metabolomics and traditional Chinese medicine[J].Trends in Analytical Chemistry，2014，61：207-214.

[5]Oberkersch RE，Santoro MM.Role of amino acid metabolism in angiogenesis[J].Vascul Pharmacol，2019，112：17-23.

[6]Guo N，Yang DW，Yang XF，et al.A rapid，sensitive and widely applicable method for quantitative analysis of underivatized amino acids in different biological matrices by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Separation Science，2019，42（20）：3173-3181.

[7]國際心臟病學(xué)會(huì)和協(xié)會(huì)及世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合專題組.缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中華心血管病雜志，1981，9（1）：75-78.

[8]Task Force Members.2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease：theTask Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology[J].Eur Heart J，2013，34（38）：2949-3003.

[9]Grajeda-Iglesias C，Aviram M.Specific Amino Acids Affect Cardiovascular Diseases and Atherogenesis via Protection against Macrophage Foam Cell Formation：Review Article[J].Rambam Maimonides Medical Journal，2018，9（3）：1-11.

[10]周耀中，楊濤，季雪峰，等.基于UHPLC/MS的冠心病心絞痛血瘀證患者血清代謝組學(xué)研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2018，50（6）：25-28.

[11]段俊麗，李月，王一塵，等.過量服用蛋氨酸所致高同型半胱氨酸血癥對(duì)缺血性血管新生的抑制作用[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2003，11（6）：493-497.

[12]Shi Q，Zhao H，Chen J，et al.Study on Qi Deficiency Syndrome Identification Modes of Coronary Heart Disease Based on Metabolomic Biomarkers[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：1-15.

[13]張?jiān)伷?，孔璟，吳嘉燕，等.大鼠慢性心衰致死的代謝特征與標(biāo)記物研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2018，33（4）：329-334.

[14]華何與，崔凱，關(guān)山越，等.不穩(wěn)定型心絞痛氣滯血瘀證與痰濁痹阻證的血漿代謝組學(xué)研究[J].光明中醫(yī)，2013，28（10）：2037-2040.

[15]簡維雄，肇凱，黃獻(xiàn)平，等.冠心病心血瘀阻證血漿代謝組學(xué)的檢測(cè)分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30（6）：579-584.