葡萄籽乙醇提取物對玉米淀粉微觀結構及回生性質的影響

姜辰昊,高增明,王 偉,孫天穎,余世鋒,王存堂

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

淀粉資源豐富,是一種可再生和生物降解的天然資源,是食品工業(yè)和化學工業(yè)重要的原材料[1]。玉米淀粉是可利用的最廉價的淀粉,其具有較好的流變和凝膠特性,通常將其在糊化后被用作增稠劑、黏合劑、穩(wěn)定劑等[2]。然而,糊化后的淀粉在降溫過程中易發(fā)生回生現(xiàn)象,導致淀粉類產(chǎn)品在存儲期間出現(xiàn)硬度增加、黏度降低、抗酸解、脫水等回生現(xiàn)象,促使其品質變劣、貨架期縮短[3]。在工業(yè)上,淀粉要經(jīng)過各種物理或化學改性以防止發(fā)生回生現(xiàn)象。物理改性法主要包括濕熱處理、擠壓、微波和高靜水壓處理等方法,然而這些物理方法一般成本較高,不適宜大規(guī)模應用;化學修飾法主要包括對淀粉進行乙?；㈢牾；约傲姿峄确椒?但是許多用于食品的化學修飾對人體健康不夠安全[4]。因此,針對回生問題,研究者大多采用添加抗淀粉回生的食品添加劑,如黃原膠、環(huán)糊精、海藻酸鈉,與淀粉溶液混合其親水性端插入直鏈淀粉分子形成螺旋配合體,影響淀粉分子重排微環(huán)境,從而延緩淀粉重結晶,達到抑制回生的目的[3-5]。同時有研究表明將單、雙糖在淀粉糊化的過程中添加,因為單雙糖的分子較小,能夠隨水滲透并進入淀粉內(nèi)部,也可達到抑制淀粉重結晶的目的,從而抑制淀粉回生[6]。此外,將原花青素、茶多酚等多酚類物質添加到淀粉中,也可有效抑制回生作用,其原因可能是淀粉和酚類化合物的羥基形成氫鍵,從而干擾貯存過程中淀粉多聚物鏈自身的結合所致[7-8]。

葡萄籽是葡萄加工產(chǎn)業(yè)中的副產(chǎn)物之一,富含多酚類等活性物質,具有較強的抗氧化作用[9]。葡萄籽乙醇提取物(Ethanol extract of grape seed,EEGS)是從葡萄籽中提取的一種多酚類物質,其多酚含量在95%以上,EEGS包含單體酚和聚合多酚,單體酚主要是兒茶素、表兒茶素、沒食子酸及兒茶素、表兒茶素的沒食子酸酯等[10-11]。目前對葡萄籽多酚類物質的研究集中在抗氧化成分結構鑒定、抗氧化活性、抗菌活性評價以及抗慢性退行性疾病方面。然而葡萄籽中原花青素作為主要生物活性成分,其提取物對玉米淀粉回生的影響研究未見報道。葡萄籽作為葡萄加工業(yè)的副產(chǎn)品,若能將其開發(fā)利用,不僅可以保護環(huán)境、節(jié)約資源,而且能夠增加添葡萄籽的附加值,創(chuàng)造良好的經(jīng)濟與社會效益。

因此,本文欲詳細地研究EEGS對玉米淀粉回生的影響,采用掃描電鏡(SEM)、傅立葉紅外光譜儀(FTIR)X-射線衍射(XRD)、差示掃描量熱儀(DSC)、分別測定EEGS與玉米淀粉的相互作用,研究EEGS對淀粉體外消化性的影響,并進一步分析EEGS對玉米淀粉回生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責任公司;玉米淀粉 市售;α淀粉酶(20000 U/mL,)、糖化酶(100000 U/g)、乙醇、無水醋酸鈉、冰醋酸、3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、重苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉 均為分析純,天津凱通化學試劑公司。

YB-2500A多功能粉碎機 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TG20-WS高速離心機 北京京立離心機有限公司;2.5LfreezePrysystem真空冷凍干燥機 美國Labconco公司;SYJ-4數(shù)顯示電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司;MLS-3751-PC高壓滅菌鍋 長沙市匯虹化玻儀器設備有限公司;STA449F3同步熱分析儀 德國耐馳有限公司;Specdrum紅外光譜儀 美國PE公司;X射線衍射儀 德國BRUKER-AXS有限公司;UV-5100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;S-3400掃描電子顯微鏡 蘇州佐藤精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄籽乙醇提取物(EEGS)的制備 稱取葡萄籽300 g進行粉碎,加入600 mL 70%乙醇室溫下浸提2 h后,過濾取濾液。將濾渣再次進行上述提取過程,合并兩次濾液。將濾液在50 ℃真空旋轉蒸發(fā),之后經(jīng)冷凍干燥后得到的粉末即為EEGS,將EEGS儲存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 淀粉樣品的制備取 玉米淀粉10 g,分別加入占淀粉干重0%、2.5%、5%、10%的EEGS混合,并加入20 mL水后在121 ℃下糊化20 min。將糊化后樣品放入4 ℃冰箱內(nèi)分別貯存5、10、15 d后,將樣品凍干后研磨,過120目篩后,備用。

1.2.3 回生玉米淀粉顆粒電鏡掃描 對回生15 d的玉米淀粉樣品進行電鏡掃描。掃描電壓10.00 kV,電流 64.0 μA。將不同的樣品做好記錄,平穩(wěn)地固定于直徑1.0 cm的樣品臺上,噴金鍍膜,在掃描電子顯微鏡下,分別用800、10000的放大倍數(shù)、不同角度進行觀察拍照[12]。

1.2.4 回生玉米淀粉的紅外光譜測定 采用傅里葉紅外光譜儀對回生15 d的玉米淀粉樣品進行測定。準確稱取1 mg樣品與150 mg KBr進行混合,充分研磨壓片制樣,進行紅外光譜掃描,測量范圍為4000～400 cm-1,掃描次數(shù)為16次,分辨率4 cm-1。并通過所得數(shù)據(jù)計算1047/1022的比值間接代表回生程度的大小[13]。

1.2.5 回生玉米淀粉XRD射線衍射的測定 采用全自動X射線衍射儀對回生15 d的玉米淀粉進行晶型進行掃描,采用銅靶測定[14]。條件電壓40 kV,衍射角的旋轉范圍為5～30 °,掃描速度為2.0 °/min,步長0.02 °,結果用Origin 8.5進行積分計算相對結晶度。

1.2.6 回生玉米淀粉的熱力學性質測定 采用差式掃描量熱儀法對回生玉米淀粉的熱力學性質進行測定[15]。使用前用標準銦對DSC進行校準,取2～3 mg樣品放在鋁制坩堝中,用微量進樣器加入4～6 μL的蒸餾水后壓樣并平衡24 h,以空坩堝做空白,升溫范圍為20～200 ℃,載氣為氮氣,從DSC熔融曲線中讀取起始溫度T0,峰值溫度TP,及終止溫度Tc。通過Origin 8.5軟件進行積分計算各個樣品的糊化焓值。

1.2.7 回生玉米淀粉體外消化能力測定 混合酶液的配制:稱取糖化酶(100000 U/g)2 g和α淀粉酶溶液(20000 U/mL)5 mL同時溶于100 mL蒸餾水中離心取上清液即為混合酶液。

稱取淀粉樣品100 mg,加入pH5.2的醋酸緩沖溶液25 mL,37 ℃水浴5 min,加入5 mL預熱好的混合酶溶液,在540 nm下測20和120 min吸光度值,以葡萄糖為標準品,做標準曲線,方程式為y=1.6134x-0.0832,R2=0.9991,根據(jù)葡萄糖標準曲線計算淀粉在20和120 min生成還原糖的含量[16]。

快消化淀粉(RDS)%=[(G20-FG)/TS]×0.9×100

慢消化淀粉(SDS)%=[(G120-G20)/TS]×0.9×100

抗性淀粉(RS)%=[(TS-G120)/TS]×0.9×100

式中,G20為酶水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖含量(mg);G120為酶水解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);TS為樣品中總淀粉含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗結果均表示為平均值±標準偏差。采用SPSS 11.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析,并進行Duncan’s差異顯著性分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 EEGS對回生玉米淀粉微觀結構的影響

通過電鏡掃描,可以從微觀層面觀察EEGS對玉米淀粉顆粒表面結構所造成的影響,如圖1所示。由圖1a圖1c可以看出,在回生15 d后,對照組的玉米淀粉表面是不規(guī)則的粗糙多孔結構。而加入2.5%的EEGS的淀粉表面結構平整,粗糙度降低。這可能是由于冷藏條件下的回生玉米淀粉,在冷凍干燥時水分升華,對照組的不規(guī)則多孔結構就是由于孔洞內(nèi)水分損失造成的。而添加EEGS的淀粉分子的羥基與提取物中的含有大量羥基的黃酮類物質的羥基形成氫鍵,從而在冷凍升華干燥后仍然能夠保持較為光滑的表面形態(tài)[12]。

圖1 EEGS對回生玉米淀粉微觀結構的影響Fig.1 Scanning electronic micrographs showing theinfluence of EEGS on microstructure of corn starch注:a,c:對照組;b,d:添加2.5%提取物;a,b放大倍數(shù)為800×,c,d放大倍數(shù)為10000×。

2.2 EEGS對玉米淀粉紅外光譜的影響

糊化后的淀粉儲存在較低的溫度下,由于其處于熱力學不穩(wěn)定狀態(tài),無序的支鏈淀粉鏈重新定向排列、內(nèi)部水分逐漸喪失,從無序結構轉變?yōu)橛行蚪Y構,且分子間結構越有序,淀粉回生程度越大[17]。Goodfellow等通過對淀粉結構分析指出可以用紅外光譜800～1200 cm-1之間吸光度比值表征淀粉的短程有序性,其中1022 cm-1處與淀粉無定形區(qū)域相關,而1047 cm-1與淀粉有序程度相關[18]。Flores等用吸收峰1047/1022處吸光度比值來確定結晶區(qū)域的有序性,因此1047/1022吸光度的比值可以代表淀粉回生程度的大小[19]。

EEGS對玉米淀粉回生性質影響的紅外光譜如圖2所示。

圖2 EEGS添加量對玉米淀粉紅外光譜的影響(回生15 d)Fig.2 Effects of EEGS concentrations on theFTIR spectra of corn starch after retrogradation for 15 d

從表1可知,在添加不同濃度EEGS的作用下,回生15 d的玉米淀粉在1047/1022處表征的吸光度值均有所下降,表明EEGS可抑制玉米淀粉的回生。而添加2.5%的EEGS玉米淀粉,其1047/1022吸光度的比值從對照組的1.11下降到了1.06,下降幅度較大,說明添加2.5%的EEGS對玉米淀粉回生有最佳的抑制效果。

表1 EEGS添加量對1047/1022比值的影響(回生15 d)Table 1 Effects of EEGS concentrations on the 1047/1022ratio values of corn starch after retrogradation for 15 d

2.3 EEGS對玉米淀粉XRD射線衍射圖的影響

XRD分析測定的是不同EEGS添加量時玉米淀粉樣品在回生后的最終重結晶情況。而當?shù)矸刍厣?16.9 °(2θ)處有很強的吸收峰,這是B-型結晶典型的特征[17]。當添加不同濃度的EEGS后,淀粉回生樣品在16.9 °(2θ)處的衍射強度均有所下降,說明EEGS的添加可有效抑制玉米淀粉的的回生。這可能是由于黃酮類物質含有大量的羥基,可以通過非共價相互作用與直鏈淀粉或者支鏈淀粉的部分分支之間發(fā)生相互作用,限制了淀粉分子之間的重結晶,從而抑制淀粉的回生過程[20]。

圖3 EEGS添加量對回生玉米淀粉XRD射線衍射圖的影響(回生15 d)Fig.3 Effects of EEGS concentrations on theX-ray diffraction of corn starch after retrogradation for 15 d

根據(jù)表2中淀粉相對結晶度的結果可以看出,添加不同濃度的EEGS的淀粉相對結晶度均有所下降。添加2.5%的EEGS的淀粉相對結晶度比對照組下降了13.15%,但是添加量增大到5%和10%時,回生淀粉樣品的相對結晶度反而高于添加量為2.5%時的樣品,但是相對結晶度依然低于對照組。說明EEGS的添加量與玉米淀粉相對結晶度下降并沒有濃度依賴關系,添加量為2.5%時可達到較好的抑制回生的效果。

表2 EEGS添加量對玉米淀粉相對結晶度的影響(回生15 d)Table 2 Effects of EEGS concentrations on therelative crystallinity of corn starch after retrogradation for 15 d

2.4 EEGS對玉米淀粉的熱力學性質的影響

淀粉的熔融焓值代表在與水共熱的條件下,解開淀粉分子中雙螺旋結構能量的大小,其本質是親水性的羥基基團與支鏈淀粉的側鏈相互作用,并在不同程度上結合到淀粉顆粒的無定形區(qū)域,從而改變結晶區(qū)和無定形基質之間的耦合力[16]。如表3所示,回生5 d,EEGS的添加對淀粉的熔融焓值的影響是顯著的,且隨著濃度的增加淀粉的熔融焓值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。添加2.5%、5%、10%的EEGS的淀粉的熔融焓值分別比對照組均有所下降,回生10和15 d淀粉的熔融焓值依然呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,且隨著回生天數(shù)的增加熔融焓值也在不斷上升。這可能是由于回生程度的增大導致分子間氫鍵的作用力逐漸增強,破壞分子內(nèi)部雙螺旋結構越來越困難。但不論在5、10、15 d中,添加2.5%的EEGS的淀粉都能保持最低的回生程度。

表3 不同濃度的EEGS對回生玉米淀粉的熱力學性質的影響Table 3 Effects of EEGS concentrations on the gelatinization thermal properties of corn starch after retrogradation

2.5 EEGS對玉米淀粉體外消化的影響

由表4可知,隨著EEGS添加量的增加,玉米淀粉中快消化淀粉(RDS)含量下降,慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的含量增加,并呈現(xiàn)濃度依賴關系。當EEGS添加量為10%時,與對照組相比,在4 ℃回生5 d的玉米淀粉中的RDS下降了63.79%,SDS和RS分別增加了約2倍和14倍。此外,隨著回生時間的延長,對照組中玉米淀粉中的RDS的含量下降較快,而隨著EEGS的添加量增大,玉米淀粉中RDS的含量下降趨勢明顯減緩,這也說明EEGS的添加抑制了玉米淀粉的回生過程。這可能由于EEGS中原花青素的多羥基結構形成較多的氫鍵,同時淀粉的顆粒表面被原花青素的多羥基結構緊緊包圍,減少了酶對淀粉消化作用的表面積[21]。從而阻止酶對淀粉的水解位點所致,韋冷云也發(fā)現(xiàn)向淀粉中添加一定比例的菊糖,淀粉的水解率會有一定程度的降低[22]。

表4 不同濃度的EEGS對回生淀粉的體外消化性質的影響Table 4 Effects of EEGS concentrations on digestive properties of corn starch after retrogradation

3 結論

將EEGS(富含多酚類物質)添加到玉米淀粉中,其回生焓值、相對結晶度、1047/1022的比值均明顯降低,回生后的玉米淀粉微觀結構發(fā)生改變,均說明EEGS對玉米淀粉的回生有抑制作用。EEGS的添加量對回生的抑制程度有明顯影響,添加2.5%的對回生的抑制效果較好。此外,EEGS的添加促使玉米淀粉的消化體外消化性能下降,快消化淀粉含量下降、慢消化淀粉、抗性淀粉含量增加。EEGS可作為玉米淀粉回生抑制劑、抗性淀粉生產(chǎn)的添加劑的潛在來源,在食品加工中被開發(fā)利用。