HPLC法測(cè)定腫節(jié)風(fēng)提取物中反丁烯二酸的方法及優(yōu)化

龍昶文 韋劍發(fā) 李盛毅 李柏蓉 黎冬梅 朱曉瑩

摘 要 目的：探索及優(yōu)化HPLC法測(cè)定腫節(jié)風(fēng)提取物中反丁烯二酸的方法。方法：采用單因素試驗(yàn)分別對(duì)HPLC法測(cè)定腫節(jié)風(fēng)提取物中反丁烯二酸的流動(dòng)相比例、流動(dòng)相PH值、流速、柱溫進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)定4個(gè)水平，以找出每個(gè)因素的最適宜水平。結(jié)果：在乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速為1ml/min，柱溫28℃條件下，對(duì)對(duì)照品與供試品進(jìn)行色譜分離結(jié)果較滿意。結(jié)論? 經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件可以用于測(cè)定腫節(jié)風(fēng)中反丁烯二酸含量。

關(guān)鍵詞 腫節(jié)風(fēng) 反丁烯二酸 高效液相色譜法 單因素試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

腫節(jié)風(fēng)為近年研究較多的中草藥，又名草珊瑚、九節(jié)茶等，味苦，辛，性平，具有清熱涼血，活血消斑，祛風(fēng)通絡(luò)的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分主要有：有機(jī)酸、黃酮、倍半萜、揮發(fā)油、香豆素等多種化學(xué)成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等多種活性。

1儀器與試藥

高效液相色譜儀：戴安 -3000高效液相色譜儀，紫外可變檢測(cè)器（ 3000），變色龍6.8工作站、色譜柱：AccLaim C18（250nm？.6nm，5 m）、電子分析天平、水浴鍋、超純水儀、負(fù)壓過(guò)濾器、超聲波清洗器、中藥粉碎機(jī)。對(duì)照品反丁烯二酸（批號(hào)：111541-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、腫節(jié)風(fēng)藥材（購(gòu)于百色市生物醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)地：玉林）經(jīng)本院張樹球教授鑒定為腫節(jié)風(fēng)藥材。磷酸為分析純、乙腈為色譜純，超純水。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品和供試品的制備

精密稱取反丁烯二酸對(duì)照品8mg，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 m有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾即可。

精密稱定腫節(jié)風(fēng)藥材莖粉末1.0g，置100ml錐形瓶中，加入約50ml甲醇，于70℃水浴回流提取1h，將提取液于60℃水浴揮干，殘?jiān)靡译妫ㄔ号c乙腈體積比為4：1）超聲10min溶解，0.45 m有機(jī)濾膜過(guò)濾，即為供試品。

2.2對(duì)照品檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液，在流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（20：80），流速1ml/min，柱溫30℃、進(jìn)樣量為20 l的條件下，進(jìn)行3D紫外掃描，反丁烯二酸在220nm有最大吸收峰，選擇220nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3單因素試驗(yàn)

以流動(dòng)相的配比、流動(dòng)相PH值、流速、柱溫作為影響色譜分離效果的單因素，分別對(duì)反丁烯二酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分離，以找出不同因素的適宜范圍。

2.3.1流動(dòng)相的配比對(duì)色譜分離的影響

在柱溫為28℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、流動(dòng)相磷酸PH2.9、流速為1ml/min，進(jìn)樣量為20 l的條件下，以乙腈：磷酸體積比分別為：V：V=25：75、20：80、15：85、13：87條件下，分別進(jìn)樣色譜分離。結(jié)果以乙腈-磷酸V：V=15：85色譜分離效果較佳。

2.3.2流動(dòng)相PH值對(duì)色譜分離的影響

在柱溫為28℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、流速為1ml/min，進(jìn)樣量為20 l的條件下，以磷酸PH 2.9、3、3.5、4條件下，分別進(jìn)樣色譜分離。結(jié)果以磷酸PH=3色譜分離效果較佳。

2.3.3流速對(duì)色譜分離的影響

在柱溫為28℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3，進(jìn)樣量為20 l的條件下，以流速為0.8、0.9、1、1.5ml/min條件下，分別進(jìn)樣色譜分離。結(jié)果以流速為1ml/min色譜分離效果較佳。

2.3.4柱溫對(duì)色譜分離的影響

在檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速為1ml/min，進(jìn)樣量為20 l的條件下，以柱溫為26、28、30、35℃條件下，分別進(jìn)樣色譜分離。結(jié)果以柱溫28℃色譜分離效果較佳。

2.4對(duì)照品及樣品測(cè)定結(jié)果

在檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速為1ml/min，柱溫28℃，進(jìn)樣量為20 l的條件下，分別進(jìn)樣色譜分離，結(jié)果見(jiàn)下圖1。

3討論

影響色譜分離效果的因素主要有HPLC檢測(cè)器;色譜柱填料孔徑大小及其粒徑分布均勻性、色譜柱直徑;流動(dòng)相的組成、比例、PH值;流速;柱溫;進(jìn)樣量等。欲分離出較理想的色譜圖，須對(duì)上述影響因素進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，相比硬件設(shè)施的改變，對(duì)流動(dòng)相、流速、柱溫等因素進(jìn)行優(yōu)化更經(jīng)濟(jì)可行。在本實(shí)驗(yàn)室條件下，按照參考文獻(xiàn)提供方法得到圖譜并不理想。經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，在檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速為1ml/min，柱溫28℃，進(jìn)樣量為20 l的條件下，對(duì)照品與供試品進(jìn)行色譜分離較滿意，理論塔板數(shù)不低于2000。為下一步實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造條件。

基金項(xiàng)目：右江民族醫(yī)學(xué)院教改立項(xiàng)項(xiàng)目（右醫(yī)院字[2011]28號(hào)）;右江民族醫(yī)學(xué)院2013年度校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目（XJACX201316）。

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