葡萄ISSR—PCR反應(yīng)體系的建立與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

張娜+李群+高興旺+賴曉輝+李佳+丁金鵬

摘要：建立和優(yōu)化穩(wěn)定的葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展葡萄遺傳多樣性研究和品種選優(yōu)提供理論依據(jù)。運(yùn)用改良的CTAB法從葡萄嫩葉中提取基因組總DNA，通過單因素試驗(yàn)分析dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、DNA模板用量、Taq DNA聚合酶用量等5個(gè)因素對(duì)葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果的影響，并采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法優(yōu)化建立葡萄ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。優(yōu)化的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：10×PCR buffer、0.225 mmol/L dNTPs、Taq DNA聚合酶1.0 U、1.00 μmol/L引物、2.75 mmol/L Mg2+、DNA模板30 ng。利用優(yōu)化的ISSR-PCR 反應(yīng)體系能夠擴(kuò)增獲得清晰、穩(wěn)定的DNA條帶，可用于后續(xù)的葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞：葡萄；ISSR-PCR；反應(yīng)體系；單因素試驗(yàn)；正交設(shè)計(jì)；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S663.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0047-04

葡萄屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.）藤本植物，是起源最古老的果樹之一，其果實(shí)可用于釀酒、鮮食、制汁等，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。由于葡萄的基因組高度雜合，使得其具有豐富的種質(zhì)資源。種質(zhì)資源是進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和創(chuàng)新育種的重要物質(zhì)保障，也是解決各種病蟲害問題有利的“基因武器庫(kù)”。因此，充分了解葡萄種質(zhì)資源的遺傳信息、分析其種質(zhì)資源遺傳多樣性，對(duì)有效利用現(xiàn)有的葡萄種質(zhì)資源以及促進(jìn)和加快葡萄分子育種進(jìn)程具有重要意義。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于葡萄遺傳多樣性研究，以期為進(jìn)一步開展葡萄分子育種奠定了一定的基礎(chǔ)。黃遠(yuǎn)飛利用RAPD技術(shù)對(duì)53份葡萄材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)53份葡萄材料間具有較高的遺傳多樣性[1]。吳子龍等建立了葡萄SSR標(biāo)記和ISSR的反應(yīng)體系，并研究了葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性[2-3]。張淑靜利用SSR技術(shù)分析了39份葡萄品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)這些材料間存在明顯的遺傳多態(tài)性差異[4]。郭大龍等建立了適用于葡萄的SRAP反應(yīng)體系，為葡萄種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳改良等研究提供了基礎(chǔ)[5]。張君玉等建立了葡萄的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性的反應(yīng)體系，可用于葡萄種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)[6]。賴呈純等也分別建立了適用于葡萄的ISSR-PCR反應(yīng)體系。ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了SSR和RAPD等2種標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但其最關(guān)鍵的步驟是須要針對(duì)不同的物種建立相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系[7-8]。雖然前人已建立了適用于葡萄的ISSR技術(shù)的PCR反應(yīng)體系，但均未對(duì)Mg2+這一影響因素進(jìn)行分析，因此本研究通過優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)中的各項(xiàng)參數(shù)，建立適用于葡萄ISSR技術(shù)的最佳反應(yīng)體系。以新疆葡萄種質(zhì)資源嫩葉為材料，通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化葡萄種質(zhì)資源ISSR反應(yīng)體系，并對(duì)PCR反應(yīng)過程中的退火溫度進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步開展葡萄遺傳多樣性研究和品種選優(yōu)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葡萄種質(zhì)嫩葉采自新疆鄯善縣新疆瓜果研究中心葡萄種質(zhì)資源圃，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。ISSR引物序列參考哥倫比亞大學(xué)公布的序列，送往華大基因進(jìn)行合成；所用試劑dNTPs和Taq DNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq酶）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄幼葉基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用改良的CTAB法提取葡萄幼葉基因組DNA[9]。改良的CTAB配方為：3% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、2 mmol/L NaCl、4% PVP40、2% β-巰基乙醇、20 mmol/L偏重亞硫酸鈉；提取步驟參照徐美隆等的方法[10]進(jìn)行。取1.0 μL DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)D260 nm/D280 nm，從而確定DNA的濃度和純度。

1.2.2 單因素篩選試驗(yàn) 研究dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物UBC848[（CA）8RG]濃度、DNA模板用量、Taq酶用量5個(gè)因素對(duì)ISSR-PCR體系的影響（表1）。在單因素分析過程中，當(dāng)對(duì)某一個(gè)因素進(jìn)行梯度優(yōu)化時(shí)，其他因素保持不變，得到的最優(yōu)濃度帶入下一個(gè)因素的梯度試驗(yàn)，依次進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)擴(kuò)增3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min[11]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)篩選出的dNTPs濃度和Mg2+濃度等的較優(yōu)濃度進(jìn)一步細(xì)化，引物濃度和DNA模板用量則直接使用單因素篩選的3個(gè)較適水平。采用L9（34）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，檢測(cè)dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物UBC848濃度及DNA模板用量對(duì)ISSR-PCR 結(jié)果的影響，從中篩選出最佳組合，方案如表2所示，擴(kuò)增程序與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

1.2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系退火溫度的優(yōu)化 利用溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，對(duì)引物842[（GA）8YG]設(shè)置11個(gè)溫度梯度，即48.0、48.4、49.3、50.7、52.2、53.8、55.5、57.1、58.6、60.0、60.9 ℃，篩選最佳退火溫度。

1.2.5 最佳體系穩(wěn)定性檢測(cè) 利用篩選的最佳體系和引物842對(duì)24個(gè)不同葡萄品種DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)最優(yōu)體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄幼葉基因組DNA純度的檢測(cè)結(jié)果

采用改良的CTAB法提取的葡萄幼葉基因組DNA無色、透明，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，D260 nm/D280nm均在1.75～1.88范圍內(nèi)；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，DNA條帶清晰、明亮、整齊、雜質(zhì)含量低且基本無降解，可用于開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系單因素水平的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 由圖2可知，隨著dNTPs濃度的逐漸增大，擴(kuò)增的條帶數(shù)和條帶亮度均逐漸增高；當(dāng)dNTPs濃度為 0.05 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)不完全，擴(kuò)增的條帶數(shù)少且亮度暗；dNTPs濃度為0.20～0.30 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增的條帶多且亮度較高，所以初步確定dNTPs濃度在0.20～0.30 mmol/L較為合適。

2.2.2 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 從圖3可以看出，Mg2+濃度在0.5～3.5 mmol/L范圍內(nèi)增大時(shí)，擴(kuò)增條帶明顯增多，當(dāng)Mg2+濃度為2.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)達(dá)到最高，當(dāng)Mg2+濃度增大至2.0～3.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)基本不變，但亮度增加。因此，初步確定Mg2+濃度在2.0～3.0 mmol/L 較為合適。

2.2.3 DNA模板用量對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 不同DNA模板用量的擴(kuò)增結(jié)果（圖4）顯示，DNA模板濃度在20～120 ng范圍內(nèi)逐漸增大時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)基本不變，但條帶亮度有所增加；其中模板濃度在40～80 ng時(shí)，條帶亮度最佳，繼續(xù)增至100 ng時(shí)，條帶亮度過高，因此初步確定DNA模板濃度在40～80 ng較合適。

2.2.4 引物濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 不同引物濃度擴(kuò)增結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)引物濃度在0.25～1.25 μmol/L范圍內(nèi)逐漸增大時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶的數(shù)量增加，亮度也有所增大，當(dāng)濃度為1.25 μmol/L時(shí)條帶最多；當(dāng)引物濃度繼續(xù)增至1.75 μmol/L時(shí)，PCR擴(kuò)增出的條帶數(shù)量和亮度變化不明顯，因此初步確定引物濃度在0.75～1.25 μmol/L較合適。

2.2.5 Taq酶用量對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 由圖6可知，Taq酶用量為0.5 U時(shí)，條帶亮度較暗，當(dāng)Taq酶用量在1.0 U 時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶亮度明顯增大；隨著Taq酶用量的繼續(xù)增加，PCR擴(kuò)增的條帶亮度增加不明顯，所以最終確定Taq酶用量為1 U。

2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

由圖7可知，1號(hào)組合片段模糊，2號(hào)、3號(hào)組合小片段未擴(kuò)增出，4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)組合大片段擴(kuò)增結(jié)果較模糊，只有5號(hào)組合條帶亮度均勻且穩(wěn)定。綜合考慮條帶亮度及豐富度，最終確定5號(hào)組合為最佳的ISSR-PCR反應(yīng)體系組合，即每20 μL的反應(yīng)體系中含有10×PCR buffer（Mg2+ free）、dNTPs 0.225 mmol/L、Taq酶1.0 U、引物1.00 μmol/L、Mg2+ 2.75 mmol/L、DNA模板30 ng。

2.4 最適退火溫度的確定

引物842不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果（圖8）顯示，當(dāng)退火溫度較低時(shí)，ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶模糊，說明擴(kuò)增的特異性較差；當(dāng)退火溫度較高時(shí)，擴(kuò)增出大片段但條帶模糊，說明擴(kuò)增效率不高；退火溫度為55.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)較多且條帶清晰。因此，確定55.5 ℃為引物842的最佳退火溫度。

2.5 優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

以24個(gè)葡萄品種為材料，檢測(cè)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中組合5的 PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，結(jié)果（圖9）顯示，所有品種均能得到較為清晰整齊的條帶。說明該正交組合可用于不同葡萄品種中擴(kuò)增出較好的條帶，適用于葡萄的ISSR分析。

3 結(jié)論與討論

ISSR技術(shù)是基于PCR的一種分子標(biāo)記，其擴(kuò)增反應(yīng)常受引物濃度、DNA模板用量、Mg2+濃度、dNTP濃度及Taq酶用量等多種因素的影響，此外，反應(yīng)體系還受退火溫度的影響[12]。因此，本研究針對(duì)這些影響因子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并建立葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系，結(jié)果表明，引物濃度、DNA模板用量、Mg2+濃度、dNTP濃度及Taq酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果均有不同程度的影響，并篩選出55.5 ℃為引物842的最佳退火溫度。

目前，已有不少研究者建立了適用于葡萄的ISSR-PCR反應(yīng)體系，但均未對(duì)Mg2+濃度這一影響因素進(jìn)行分析。通過本研究結(jié)果可以看出，Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響較明顯，可能是因?yàn)門aq酶需Mg2+激活，同時(shí)引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈也受二價(jià)陽離子的影響[13]。最終確定Mg2+濃度為2.75 mmol/L，與茶樹[14]、楊樹[15]、枇杷[16]等物種的最適Mg2+濃度接近。

DNA模板的質(zhì)量是保證ISSR-PCR擴(kuò)增的重要因素之一，最佳的模板濃度范圍取決于研究物種和模板純度。在DNA 模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內(nèi)的最低限度，使抑制Taq酶活性的影響降到最低[14]。宣繼萍等確定蘋果ISSR反應(yīng)體系中DNA模板用量為20 ng[17]，劉曉靜等確定益智ISSR反應(yīng)體系中DNA模板用量為100 ng[18]，代培紅等確定葡萄ISSR反應(yīng)體系中DNA模板用量為30 ng[8]，可見不同物種研究須確定不同的ISSR-PCR模板用量。本研究確定DNA模板用量為30 ng，與代培紅等的研究結(jié)果[8]一致。

在其他條件不變的情況下，當(dāng)引物濃度過高時(shí)，引物結(jié)合模板的效率增高，進(jìn)而導(dǎo)致大量的非特異性擴(kuò)增，同時(shí)引物本身也容易形成二聚體，導(dǎo)致部分dNTPs和Taq酶被消耗，從而降低模板的擴(kuò)增效率；當(dāng)引物濃度過低時(shí)，引物與模板不能有效結(jié)合，則導(dǎo)致不能有效檢測(cè)出所有的相應(yīng)位點(diǎn)，使得多態(tài)性降低[19]。本研究確定引物濃度為1.00 μmol/L，高于賴呈純等對(duì)葡萄種質(zhì)資源ISSR體系的研究結(jié)果[7-8]，這可能與試驗(yàn)材料、條件不同有關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度會(huì)顯著影響PCR擴(kuò)增效率，濃度過高，會(huì)造成錯(cuò)誤滲入；濃度過低，則會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)率[16]。在羅漢果[12]、龍眼[20]等物種中確定的最適dNTPs濃度為0.1～0.8 mmol/L，本研究確定的dNTPs濃度為0.225 mmol/L，在上述研究范圍之內(nèi)，且濃度更精確。

酶的用量也直接關(guān)系到試驗(yàn)結(jié)果，量多不僅會(huì)增加試驗(yàn)成本，還容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；量少則會(huì)使酶過早地消耗完，產(chǎn)物合成效率低[18]。本研究最終確定Taq酶用量為1.0 U，與周俊亞等的研究結(jié)果[12，21]一致。

本研究結(jié)果表明，不同的反應(yīng)體系擴(kuò)增的ISSR結(jié)果有一定的差異，PCR反應(yīng)體系的質(zhì)量直接影響后續(xù)ISSR-PCR的準(zhǔn)確性。在體系研究過程中，一方面要保證體系的完整性，另一方面又要考慮到試驗(yàn)成本問題，須在二者之間找到一個(gè)平衡點(diǎn)，因此本研究在單因素試驗(yàn)找出各因素較合適的濃度范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交設(shè)計(jì)分析，最終確定最佳的反應(yīng)體系，且建立的葡萄ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可為后續(xù)的葡萄種質(zhì)資源分析、品種鑒定、遺傳多樣性分析、分子育種等方面的研究提供參考。利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的ISSR-PCR反應(yīng)體系可在一系列的葡萄品種中擴(kuò)增獲得清晰、穩(wěn)定的DNA條帶，可用于后續(xù)的葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

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