自擬活血壯骨湯對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠作用機(jī)制研究?

楊博鴻 田聰陽 張志清 柴欣樓

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種以疼痛及關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙為主要癥狀的疾病，是膝關(guān)節(jié)軟骨和滑膜、肌肉、軟骨下骨、皮質(zhì)骨等膝關(guān)節(jié)軟骨周圍組織相互作用的結(jié)果[1]。由于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是一種靜止細(xì)胞，在一般情況下不會(huì)自我增殖、修復(fù)，因此臨床治療較為困難。目前，對(duì)于輕中度的KOA患者，以緩解疼痛、緩解軟骨損傷、改善患者生活質(zhì)量為主要治療原則。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病是由正氣不足、肝腎虧損所致。本課題組自擬方活血壯骨湯由懷牛膝、川芎、當(dāng)歸、杜仲、桑寄生、狗脊組成，其中牛膝通而能補(bǔ)，性善下行，川芎活血行氣止痛，當(dāng)歸補(bǔ)血活血止痛，杜仲、狗脊、桑寄生補(bǔ)肝腎強(qiáng)腰脊，諸藥配伍具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血通絡(luò)止痛的功效。本實(shí)驗(yàn)以木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠KOA模型為研究對(duì)象，研究活血壯骨湯的治療作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250 g，由北京斯貝福公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016-0002。

1.2 試藥與儀器

活血壯骨湯，組方：懷牛膝15 g，川芎10 g，當(dāng)歸12 g，杜仲11 g，狗脊15 g，桑寄生10 g。由北京同仁堂公司提供，北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院制劑室制備，加工為含生藥1 g/mL的湯劑。木瓜蛋白酶（BIOR-uler公司）；L-半胱氨酸（Abfans公司），鹽酸氨基葡萄糖膠囊（北京康必得藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20170173）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（天津安諾瑞康有限公司）；BP211D分析天平（德國(guó)賽多利斯有限公司）；BS系類電子天平（上海友聲衡器有限公司）；游標(biāo)卡尺（上海恒勝工具有限公司）；YLS-7C足趾容積儀（廣州市飛迪生物有限公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.3 分組與造模

40只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、活血壯骨湯低劑量組、活血壯骨湯高劑量組、陽性對(duì)照組，每組各8只?？瞻捉M不做任何處理，其他組用2%的木瓜蛋白酶溶液與0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液，按照2∶1的比例混合，將大鼠膝關(guān)節(jié)屈曲45°，以髕骨下極白色髕腱外緣的膝眼為進(jìn)針點(diǎn)，向髁間窩方向穿刺進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回撤2 mm，每周注射2次，每次每個(gè)膝關(guān)節(jié)腔0.15 mL，連續(xù)4周。

1.4 給藥方法

造模完成后開始灌胃給藥，活血壯骨湯低劑量組予活血壯骨湯75 mg/（kg·d），活血壯骨湯高劑量組予活血壯骨湯300 mg/（kg·d），陽性對(duì)照組給予鹽酸氨基葡萄糖藥液157.5 mg/（kg·d），模型組、空白組給予等量的0.9%氯化鈉注射液，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 大鼠一般狀況觀察 于造模結(jié)束后和給藥4周后，觀察大鼠體征的變化，包括毛發(fā)、精神狀況、活動(dòng)情況等。

1.5.2 大鼠膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積測(cè)量 于造模結(jié)束后和給藥4周后，用游標(biāo)卡尺對(duì)大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑進(jìn)行測(cè)量集，對(duì)兩個(gè)時(shí)期的關(guān)節(jié)直徑進(jìn)行比較；用足趾容積儀對(duì)大鼠的足趾容積進(jìn)行測(cè)量集，對(duì)兩個(gè)時(shí)期的足趾容積進(jìn)行比較。

1.5.3 血清細(xì)胞因子的檢測(cè) 連續(xù)給藥4周后，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，采用腹主動(dòng)脈取血的方法采集血樣，3 000 r/min離心30 min，取100 μL上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。

1.5.4 大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察 采血后處死大鼠，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，充分剝離皮膚肌肉之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%稀鹽酸脫鈣2～4 d，梯度脫水后石蠟包埋，行額狀面切片（沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨下松質(zhì)骨和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，厚度約5 μm），行染色，常規(guī)脫水、透明、封片處理。鏡下用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]對(duì)軟骨組織病理學(xué)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，所得評(píng)分越高，說明關(guān)節(jié)炎病變程度越高。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況觀察

造模結(jié)束后，空白組的大鼠毛發(fā)整齊光滑，情緒不易激怒，納食正常，活動(dòng)未受限；模型組大鼠皮毛雜亂無章、無光澤，情緒急躁易怒，活動(dòng)減少。給藥4周后，活血壯骨湯低劑量組較空白組活動(dòng)較少，下肢運(yùn)動(dòng)受限，易激怒程度較高，活血壯骨湯高劑量組以及陽性對(duì)照組皮毛有光澤，下肢運(yùn)動(dòng)輕微受限，情緒不易激怒。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑比較

見表1。造模完成后，與空白組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑明顯增大（P＜0.05）。給藥4周后，與模型組比較，各用藥組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑值均降低（P＜0.05）；陽性對(duì)照組與活血壯骨湯高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；活血壯骨湯低劑量組與陽性對(duì)照組以及活血壯骨湯高劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑比較（mm，±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑比較（mm，±s）

與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，#P＜0.05。下同

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對(duì)照組n 8 8 8 8 8造模4周后7.165±0.097 8.050±0.092*8.103±0.110*8.118±0.114*8.126±0.128*給藥4周后7.309±0.090▲#8.163±0.079#8.003±0.108▲#7.905±0.121▲7.873±0.149▲

2.3 各組大鼠足趾容積比較

見表2。造模完成后，與空白組比較，模型組大鼠足趾容積明顯增大（P＜0.01）；給藥4周后，與模型組比較，各用藥組大鼠足趾容積均降低（P＜0.05）；各用藥組之間，陽性對(duì)照組與活血壯骨湯高劑量組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；活血壯骨湯低劑量組與陽性對(duì)照組及活血壯骨湯高劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠足趾容積比較（mL，±s）

表2 各組大鼠足趾容積比較（mL，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對(duì)照組n 8 8 8 8 8造模4周后1.431±0.028 1.644±0.031*1.641±0.029*1.629±0.020*1.626±0.023*給藥4周后1.438±0.032▲#1.639±0.048#1.541±0.040▲#1.484±0.033▲1.475±0.038▲

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

見表3。給藥4周后，與空白組比較，其余各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組比較，活血壯骨湯高、低劑量組血清TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），活血壯骨湯高劑量組血清TNF-α水平顯著低于陽性對(duì)照組及活血壯骨湯低劑量組（P＜0.05）。與陽性對(duì)照組比較，活血壯骨湯高劑量組血清IL-1β含量差別不大（P＞0.05），活血壯骨湯低劑量組的血清IL-1β含量高于陽性藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對(duì)照組n 8 8 8 8 8 TNF-α 24.539±4.241▲#74.188±3.588*#54.621±3.728*▲#40.103±5.815*▲#47.879±5.165*▲IL-1β 17.488±4.292▲#90.29±19.942*#65.355±9.256*▲#53.714±4.027*▲54.056±6.219*▲

2.5 病理切片觀察結(jié)果

2.5.1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨甲苯胺藍(lán)染色切片 見圖1?？瞻捉M：甲苯胺藍(lán)染色軟骨表面平整光滑，表面無裂縫或者缺損，無骨贅的生成，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，關(guān)節(jié)軟骨4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，潮線清晰完整，軟骨基質(zhì)染色均勻成藍(lán)色。模型組：關(guān)節(jié)軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，伴有骨贅的生成；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)異常，排列紊亂，各個(gè)層次不能清晰辨識(shí)出，潮線完全缺損，軟骨細(xì)胞大量減少，出現(xiàn)大量空軟骨陷窩，關(guān)節(jié)軟骨染色不均勻，蛋白聚糖出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧蛣┝拷M：關(guān)節(jié)軟骨表面相對(duì)于模型組較光滑平整，相對(duì)于正常組，軟骨細(xì)胞形態(tài)較為異常，排列較為紊亂，潮線被破壞，部分部位出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的缺失，有相對(duì)較多的空軟骨陷窩，基質(zhì)染色不均勻，蛋白多糖出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧邉┝拷M和陽性對(duì)照組：相較于模型組，軟骨表面平整，細(xì)胞排列較為整齊，關(guān)節(jié)軟骨4層結(jié)構(gòu)基本清晰可見，潮線大致完整，染色較為均勻，缺損的蛋白多糖有所恢復(fù)。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片（甲苯胺藍(lán)染色，400倍）

2.5.2 大鼠關(guān)節(jié)軟骨MASSON染色切片 見圖2?？瞻捉M：MASSON染色軟骨表面平整光滑，表面無裂縫或者缺損，無骨贅的生成；軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；關(guān)節(jié)軟骨4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，潮線清晰完整，軟骨基質(zhì)染色均勻成藍(lán)色。模型組：關(guān)節(jié)軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，伴有骨贅的生成；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)異常，排列紊亂，各個(gè)層次不能清晰辨識(shí)出，潮線完全缺損，軟骨細(xì)胞大量減少，出現(xiàn)大量空軟骨陷窩，關(guān)節(jié)軟骨染色不均勻，膠原纖維出現(xiàn)丟失。活血壯骨湯低劑量組：關(guān)節(jié)軟骨表面相對(duì)于模型組較光滑平整，相對(duì)于正常組，軟骨細(xì)胞形態(tài)較為異常，排列較為紊亂，潮線被破壞，部分部位出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的缺失，有相對(duì)較多的空軟骨陷窩，基質(zhì)染色不均勻，膠原纖維出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧邉┝拷M和陽性對(duì)照組：與模型組比較，軟骨表面平整，細(xì)胞排列較為整齊，關(guān)節(jié)軟骨4層結(jié)構(gòu)基本清晰可見，潮線大致完整，染色較為均勻，缺損的膠原纖維有所恢復(fù)。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片（MASSON染色，200倍）

2.6 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷OARSI評(píng)分

見表4。與空白組大鼠比較，其余各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷OARSI評(píng)分均偏高（P＜0.05）。其中活血壯骨湯高劑量組及陽性對(duì)照組的OARSI評(píng)分要明顯低于活血壯骨湯低劑量組（P＜0.05）?；钛獕压菧邉┝拷M與陽性對(duì)照組的OARSI評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷OARSI評(píng)分比較（分，±s）

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷OARSI評(píng)分比較（分，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對(duì)照組n 8 8 8 8 8 OARSI評(píng)分0.32±0.41▲#★2.28±0.78*#1.83±0.54*▲#1.05±0.62*▲1.18±0.57*▲

3 討 論

KOA主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性退變，繼發(fā)于炎癥相關(guān)的增生和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，女性的患病概率明顯高于男性。KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，其發(fā)病與肝、脾、腎虧損及風(fēng)、寒、濕、瘀血客于局部密切相關(guān)，最終導(dǎo)致局部氣滯血瘀、脈絡(luò)痹阻不通而發(fā)病[3]。臨床大樣本研究顯示肝腎虧虛是KOA的基礎(chǔ)證型，瘀血貫穿KOA的始終[4]。由此，可以認(rèn)為KOA患者主要以肝腎虧損并且伴隨氣滯血瘀最為多見。在此基礎(chǔ)上本課題組自擬活血壯骨湯，其組方原則立足于“不通則痛”與“不榮則痛”，通過其補(bǔ)腎、壯骨、強(qiáng)腰膝以及活血行氣的功效達(dá)到治病求本的目的。研究表明，活血壯骨湯方中的杜仲、牛膝等藥有抗炎作用，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者起到骨保護(hù)作用[5-6]。

目前大鼠KOA模型的制備方法多種多樣，大致以關(guān)節(jié)固定、關(guān)節(jié)腔注射藥物、關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)、關(guān)節(jié)外誘導(dǎo)以及自發(fā)動(dòng)物模型為主[7]。本研究采用的是關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎，此方法操作簡(jiǎn)單方便，所用時(shí)間短，重復(fù)性好，并且與人類的骨關(guān)節(jié)炎相似[8]。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，造模完成后的大鼠關(guān)節(jié)直徑、足趾容積等與空白組比較差異均有顯著性，提示造模成功。在運(yùn)用活血壯骨湯干預(yù)后，活血壯骨湯高、低劑量組的膝關(guān)節(jié)直徑、OARSI評(píng)分均低于模型組。結(jié)果證明，活血壯骨湯能減輕KOA大鼠的炎癥反應(yīng)，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，并且與劑量呈正相關(guān)性。

普遍認(rèn)為，KOA主要是由于關(guān)節(jié)磨損所導(dǎo)致的，但是越來越多的證據(jù)表明在KOA患者關(guān)節(jié)軟骨組織、關(guān)節(jié)液以及血漿中具有高度表達(dá)的炎癥因子[9-10]。持續(xù)存在的炎癥也是KOA過程中導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的重要驅(qū)動(dòng)因素，其不僅可以引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成和分解代謝失衡，而且還能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡[11]。TNF-α是KOA發(fā)病的關(guān)鍵性的炎癥因子之一，能協(xié)同IL-1β的作用，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中起著決定性的作用[12]。TNF-α可以與IL-6協(xié)同作用，影響關(guān)節(jié)軟骨合成蛋白多糖組分、蛋白糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原蛋白。TNF-α還能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13），以及解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-4）[13]，這些可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡以及軟骨祖細(xì)胞遷移障礙，這些都剝奪了關(guān)節(jié)軟骨再生的可能[14]。TNF-α能降低呼吸鏈的效率，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的ATP減少，線粒體的膜電位降低[15]。IL-1β是KOA發(fā)病的關(guān)鍵性的炎癥因子之一，它對(duì)關(guān)節(jié)軟細(xì)胞代謝以及細(xì)胞外基質(zhì)有著顯著影響[16]。許多研究證實(shí)IL-1β可以阻礙軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，干擾關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的比如蛋白糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原蛋白的合成[17]。除開對(duì)這些關(guān)鍵物質(zhì)合成的阻礙作用外，還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的分泌來破壞關(guān)節(jié)軟骨成分[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活血壯骨湯高、低劑量組大鼠血清當(dāng)中的TNF-α、IL-1β含量均比模型組低，提示活血壯骨湯可能通過抑制TNF-α、IL-1β的分泌發(fā)揮抗炎作用，起到改善癥狀的作用。活血壯骨湯可以減輕KOA的疼痛，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，抑制炎癥因子的分泌，可以成為KOA治療的潛在方向。