基于miR-181c-3p/STAT3通路探討增液潤(rùn)燥湯治療干燥綜合征作用機(jī)制

楊瑞祥,周 全,陳慧敏,李紀(jì)高

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450099)

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome,SS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,其主要特征是腺體上皮細(xì)胞炎癥、損傷及破壞,導(dǎo)致腺體分泌減少或缺失[1]。目前,SS的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,現(xiàn)階段認(rèn)為炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)異常與其發(fā)病密切相關(guān)[2]。西醫(yī)對(duì)于SS的治療主要采用免疫抑制和替代療法,但存在臨床癥狀改善不明顯、藥物不耐受、長(zhǎng)期服藥依從性差等問(wèn)題。既往研究表明,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路直接參與SS的發(fā)病[3]。miR-181c-3p是miR-181c表達(dá)出的一個(gè)成熟序列,miR-181c模擬物的外源表達(dá)可直靶向抑制同源異形盒基因A1(Homologous heteromorphic box gene A1,HOXA1)及其下游分子STAT3的表達(dá),抑制T細(xì)胞的活化,減輕免疫炎癥[4-5]。

中醫(yī)根據(jù)臨床癥候特點(diǎn),將SS歸屬于“燥證”“燥痹”等范疇,其病因病機(jī)復(fù)雜,涉及肺、脾、肝、腎等多個(gè)臟腑[6-7]。增液潤(rùn)燥湯是我科治療SS的臨床經(jīng)驗(yàn)方,具有益氣滋陰、生津潤(rùn)燥、祛瘀通絡(luò)的功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),低、中、高劑量的增液潤(rùn)燥湯干預(yù)SS模型小鼠,均能夠顯著降低炎癥因子白介素(IL)-1β、IL-17的表達(dá)水平[8-9],但對(duì)于其具體的上下游通路尚不明確。因此,本研究通過(guò)建立SS模型小鼠,觀察各組小鼠的相關(guān)指標(biāo),從STAT3信號(hào)通路及miR-181c-3p表達(dá)的角度探討增液潤(rùn)燥湯對(duì)SS的干預(yù)機(jī)制,以期為增液潤(rùn)燥湯防治SS的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠21只,6～8周齡,體重(22.3±2.1)g,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,合格編號(hào):SCXK(京)2019-0008。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,批準(zhǔn)號(hào):MDL20220602-01。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:增液潤(rùn)燥湯(組方為北沙參、天冬、桔梗各15 g,紫菀、知母、烏梅、桃仁各10 g,制附子、炙甘草各6 g),由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診顆粒藥房提供;白芍總苷膠囊(批號(hào)210813,規(guī)格0.3 g)。免疫球蛋白G(IgG)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):CEA544Mu,武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司);Citrate檸檬酸鹽緩沖液、PBS磷酸鹽緩沖液、蘇木素染液(貨號(hào)分別為ZLI-9064、ZLI-9061、ZLI-9609,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);HOXA1抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、白細(xì)胞介素17A(IL-17A)抗體、叉頭盒蛋白P3(Foxp3)抗體、β-actin抗體(貨號(hào)分別為DF3187、AF6294、AF3293、DF6127、AF6544,美國(guó)Affinity Biosciences公司);STAT3通路激活劑[10](Colivelin,美國(guó)MCE公司);miR-181c-3p激動(dòng)劑(湖州河馬生物科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad公司);全自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)、加熱石蠟包埋系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);微量分光光度計(jì)(杭州優(yōu)米儀器有限公司);電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司);低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);流式細(xì)胞儀(常州必達(dá)科生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SS模型小鼠的建立:免疫誘導(dǎo)法制備SS模型小鼠[11]。另取同種小鼠頜下腺組織,剔除淋巴結(jié),放入PBS緩沖液中,在4 ℃條件下勻速離心5 min,充分勻漿,取上清液,檢測(cè)蛋白濃度,將蛋白與弗氏完全佐劑乳化,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400 mg/L的抗原溶液。隨機(jī)選取3只小鼠作為對(duì)照組,除對(duì)照組外,其余小鼠第0、14天經(jīng)兩側(cè)腹股溝皮下注射抗原溶液共0.1 ml,首次免疫后第2、7天時(shí),給予以上小鼠腹腔注射0.05 ml百白破聯(lián)合疫苗加強(qiáng)免疫。

1.2.2 分組和給藥:將造模成功的BALB/c小鼠隨機(jī)分為模型組、白芍總苷組、增液潤(rùn)燥湯低劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組、增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組,每組3只。另取3只作為對(duì)照組。從造模完成后即第15天開始給藥,增液潤(rùn)燥湯低、高劑量組分別給予4、12 mg/g增液潤(rùn)燥湯灌胃,白芍總苷組給予0.234 mg/g白芍總苷灌胃,模型組、對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥60 d;增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組給予1 mg/kg的Colivelin腹腔注射,2次/周,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組給予miR-181c-3p激動(dòng)劑腮腺原位多點(diǎn)注射,2次/周,持續(xù)60 d。給藥后第60天麻醉狀態(tài)下處死小鼠,進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 飲水量:每日于固定時(shí)間添加水并記錄,次日于相同時(shí)間觀察容器內(nèi)水剩余量,兩次之間的差即為小鼠每日的飲水量,連續(xù)測(cè)量60 d。

1.3.2 唾液流率:小鼠麻醉后肌肉注射毛果蕓香堿,15 min后小鼠頭向下將毛細(xì)管置于口底,收集唾液20 min;稱量收集唾液前后的毛細(xì)管重量,計(jì)算唾液量和唾液流率。唾液流率(mg/min)=唾液量(mg)/20 min。

1.3.3 頜下腺臟器指數(shù):各組小鼠于給藥后第60天稱量體重后麻醉狀態(tài)下處死,低溫摘取雙側(cè)頜下腺稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。頜下腺臟器指數(shù)(mg/g)=雙側(cè)頜下腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.3.4 紅細(xì)胞沉降率:采用自動(dòng)血沉分析儀檢測(cè)增液潤(rùn)燥湯高劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組小鼠的紅細(xì)胞沉降率。

1.3.5 血清IgG水平:收集小鼠外周血液樣本,分離血清,參照IgG檢測(cè)試劑盒指導(dǎo)步驟,采用ELISA法檢測(cè)增液潤(rùn)燥湯高劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組小鼠的血清IgG水平。

1.3.6 頜下腺組織病理學(xué)觀察:取石蠟包埋的小鼠頜下腺組織,切片后進(jìn)行脫蠟,行蘇木素-伊紅(HE)染色后脫水、透明、封片。顯微鏡下拍照,觀察頜下腺組織病理學(xué)變化。

1.3.7 RT-qPCR法檢測(cè)小鼠頜下腺miR-181c-3p的表達(dá):使用Trizol法行小鼠頜下腺組織樣本總RNA提取,微量分光光度計(jì)測(cè)定純度后使用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照以下條件反應(yīng)上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃、10 min,變性95 ℃、10 s,退火58 ℃、20 s,延伸72 ℃、20 s,共循環(huán)40次。實(shí)驗(yàn)得到每個(gè)基因的Ct值,以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列:miR-181c-3p-F:5’-TCGGCAGGACCATCGACCGTTGAG-3’,miR-181c-3p-R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3的表達(dá):取小鼠頜下腺組織,加液氮進(jìn)行勻漿,加入1 ml的PBS清洗后,估計(jì)樣品體積,加入5倍體積裂解液,混勻;裂解后以 4 ℃、12000 r/min離心15 min,收集上清;用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度;蛋白上樣Buffer將蛋白定量為5 mg/ml,-20 ℃保存?zhèn)溆?避免反復(fù)凍融;配備SDS-PAGE凝膠,分離提取蛋白并用PVDF膜轉(zhuǎn)膜;小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中封閉1 h;加入一抗后4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜;洗膜后加入二抗室溫、避光孵育60 min;采用ECL法顯色曝光、顯影沖洗,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像分析。以β-actin為各蛋白內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞含量:采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血輔助性T細(xì)胞17(Th17)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)含量,嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠日飲水量比較 見表1。給藥前,各組小鼠日飲水量無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥60 d,與模型組比較,各組小鼠日飲水量明顯下降(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組小鼠日飲水量明顯升高,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組日飲水量明顯下降(均P<0.05)。

表1 各組小鼠日飲水量比較(ml)

2.2 各組小鼠唾液流率比較 見表2。與模型組比較,各組小鼠唾液流率明顯升高(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組唾液流率無(wú)明顯變化(P>0.05),增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組唾液流率顯著升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠唾液流率比較(mg/min)

2.3 各組小鼠頜下腺指數(shù)比較 見表3。與模型組比較,對(duì)照組、增液潤(rùn)燥湯高劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組小鼠頜下腺指數(shù)明顯增高(均P<0.05)。

表3 各組小鼠頜下腺指數(shù)比較(mg/g)

2.4 各組小鼠頜下腺組織病理變化 模型組小鼠腺泡大小不等,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,形成較多浸潤(rùn)灶;對(duì)照組結(jié)構(gòu)正常,腺泡大小均勻,排列整齊,未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);白芍總苷組、增液潤(rùn)燥湯低劑量組、增液潤(rùn)燥湯高劑量組腺泡結(jié)構(gòu)基本正常,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較模型組有不同程度減少;增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量高于增液潤(rùn)燥湯高劑量組。見圖1。

圖1 各組小鼠頜下腺組織病理變化(HE染色,×400)

2.5 各組小鼠紅細(xì)胞沉降率、IgG水平比較 見表4。與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組紅細(xì)胞沉降率、血清IgG水平明顯下降(均P<0.05)。

表4 各組小鼠紅細(xì)胞沉降率、IgG表達(dá)水平比較

2.6 各組小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與模型組比較,各組HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17表達(dá)明顯下調(diào),Foxp3表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17的表達(dá)明顯下調(diào),Foxp3表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05)。見表5(圖2)。

A:模型組;B:對(duì)照組;C:白芍總苷組;D:增液潤(rùn)燥湯低劑量組;E:增液潤(rùn)燥湯高劑量組;F:增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組

表5 各組小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.7 各組小鼠頜下腺miR-181c-3p表達(dá)比較 見表6。與模型組比較,各組miR-181c-3p表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組miR-181c-3p表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

表6 各組小鼠頜下腺miR-181c-3p表達(dá)比較

2.8 各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 見表7。與模型組比較,各組Treg細(xì)胞比例明顯上升,Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg明顯下降(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+Colivelin組Treg細(xì)胞比例明顯下降,Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg明顯上升(均P<0.05);與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組Treg細(xì)胞比例明顯上升,Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg明顯下降(均P<0.05)。

表7 各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

3 討 論

中醫(yī)古籍中雖無(wú)SS病名的記載,但早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中即有“燥勝則干”“燥者濡之”的論述,其病機(jī)多以陰虛為本,可夾雜燥毒、瘀血等邪氣[12]。中醫(yī)藥可通過(guò)多途徑發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用,在本病的治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[13]。增液潤(rùn)燥湯針對(duì)本病陰虛夾雜燥毒、瘀血等的病理特點(diǎn),消補(bǔ)兼施,標(biāo)本兼顧,潤(rùn)燥得宜,行津有法,共奏津液滋潤(rùn)濡養(yǎng)之功。方中北沙參、天冬性味甘寒,共奏滋養(yǎng)肺胃、養(yǎng)陰生津之功;知母、烏梅清熱養(yǎng)陰生津;紫菀潤(rùn)肺化痰,開肺布津,與桔梗配伍,以增強(qiáng)宣發(fā)肺氣之功;附子溫腎化氣,陽(yáng)中求陰;久病必瘀,方用桃仁活血行瘀,暢通氣血運(yùn)行,使津液得以運(yùn)化全身。諸藥合用,共奏滋陰潤(rùn)燥、補(bǔ)氣生津、祛瘀通絡(luò)之功,則燥證自愈。

miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子,不編碼蛋白質(zhì),但調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14]。在機(jī)體的多種生理及病理過(guò)程中,尤其是在自身免疫性疾病中,miRNA起著關(guān)鍵作用[15]。研究表明,部分miRNA可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)育和免疫反應(yīng)[16]。miR-181c是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞活化負(fù)調(diào)節(jié)因子,當(dāng)提高細(xì)胞中miR-181c表達(dá)時(shí),可以降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平[17];miR-181c-3p是其表達(dá)出的一個(gè)成熟序列,表達(dá)水平與血清IL-17水平呈負(fù)相關(guān),是免疫系統(tǒng)疾病的新型潛在治療靶點(diǎn)[18]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,對(duì)照組及各給藥組小鼠頜下腺miR-181c-3p的表達(dá)均顯著上調(diào),且與增液潤(rùn)燥湯高劑量組比較,增液潤(rùn)燥湯高劑量+miR-181c-3p激動(dòng)劑組紅細(xì)胞沉降率與血清IgG水平明顯下降,表明增液潤(rùn)燥湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-181c-3p表達(dá)發(fā)揮對(duì)SS的治療作用。

T淋巴細(xì)胞亞群在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用[19]。Th17細(xì)胞由初始CD4 T淋巴細(xì)胞分化而來(lái),是典型的促炎細(xì)胞,Treg細(xì)胞功能與其相反,具有抗炎和免疫耐受性[20]。在生理?xiàng)l件下,機(jī)體Th17/Treg細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)平衡被打破時(shí),Th17細(xì)胞過(guò)度增殖,則會(huì)使IL-17等炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá),引發(fā)炎癥反應(yīng)[21]。研究表明,Th17/Treg細(xì)胞平衡向促炎Th17軸的轉(zhuǎn)變會(huì)加劇原發(fā)性干燥綜合征和其他自身免疫性疾病,因此調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡被認(rèn)為是調(diào)控SS免疫炎癥的關(guān)鍵[22-23]。Foxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子,Foxp3在維持Treg細(xì)胞的分化成熟及功能中發(fā)揮著重要的作用[24]。在前期研究中,本課題組證實(shí)增液潤(rùn)燥湯治療SS有著良好的療效,尤其是在降低炎性指標(biāo)等方面顯示出了一定的優(yōu)勢(shì)[8-9]。在本研究中,進(jìn)一步觀察到增液潤(rùn)燥湯可上調(diào)Foxp3的表達(dá),使Th17/Treg細(xì)胞平衡向Treg方向偏移,從而改善SS臨床癥狀。

STAT家族有7個(gè)成員,其中STAT3由約750個(gè)氨基酸組成,在控制炎癥和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化中具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[25]。STAT3磷酸化的過(guò)度增強(qiáng),可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖以及免疫球蛋白的產(chǎn)生,并抑制Treg細(xì)胞,誘發(fā)免疫炎癥[26]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫性疾病的發(fā)病中STAT3具有關(guān)鍵作用,能夠激活T淋巴細(xì)胞,因而降低STAT3的磷酸化可以對(duì)其發(fā)揮治療作用,且STAT3通路已被證明可調(diào)節(jié)SS的發(fā)病[27]。本研究發(fā)現(xiàn),增液潤(rùn)燥湯可降低STAT3的磷酸化,調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡,從而改善SS臨床癥狀,發(fā)揮治療作用。表明增液潤(rùn)燥湯可能是通過(guò)抑制STAT3通路發(fā)揮治療作用。Zhao等[28]相關(guān)研究證實(shí)miR-181c-3p通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子HOXA1的表達(dá)下調(diào)STAT3;結(jié)合本研究相關(guān)結(jié)果,提示增液潤(rùn)燥湯可以上調(diào)SS模型小鼠頜下腺中miR-181c-3p表達(dá)水平,下調(diào)其直接靶點(diǎn)HOXA1的表達(dá),抑制STAT3磷酸化,調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞失衡,減少IL-17等炎性因子的釋放,從而減少頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),發(fā)揮治療作用。

綜上所述,增液潤(rùn)燥湯可以通過(guò)上調(diào)SS模型小鼠頜下腺中miR-181c-3p表達(dá),抑制STAT3活化,從而改善Th17/Treg細(xì)胞失衡,糾正免疫炎癥失調(diào)狀態(tài)。