運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯對心力衰竭大鼠GATA-4基因及蛋白表達(dá)的影響?

任 磊 陳明慧 李平平 仲崇麗△

（1.吉林大學(xué)，吉林 長春 130000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041）

心力衰竭是一種臨床綜合征，其特征在于左心室功能障礙和體力顯著降低[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4（GATA-4）可作為眾多心臟基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，例如心房利鈉肽、B型利尿肽、β-肌球蛋白重鏈、β-肌球蛋白重鏈。GATA-4對于心臟發(fā)育至關(guān)重要[3]。GATA-4是心肌細(xì)胞對肥大刺激反應(yīng)的必要因子，并且已被認(rèn)為是培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中拉伸激活的肥大程序的核效應(yīng)子。在體外和體內(nèi)，GATA-4足以誘導(dǎo)肥大的表型，這已在GATA-4過表達(dá)的心肌細(xì)胞和發(fā)生同心性心臟肥大的轉(zhuǎn)基因小鼠中得到證實(shí)[4-5]。研究表明，GATA-4可調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，而促炎性細(xì)胞因子，尤其是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）與心力衰竭綜合征的進(jìn)展直接相關(guān)。免疫激活與低外周灌注相關(guān)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和兒茶酚胺增加，導(dǎo)致血流動力學(xué)變量和心臟結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致心力衰竭惡化[6-7]。體育鍛煉可對心力衰竭患者的神經(jīng)體液、炎性、代謝和中樞血流動力學(xué)反應(yīng)以及血管內(nèi)皮、骨骼肌和心血管功能產(chǎn)生有益影響[8]。健心湯對心力衰竭有明顯改善作用[9]。本研究擬探討運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯對心力衰竭大鼠GATA-4基因及蛋白表達(dá)的影響，為心力衰竭的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠140只，雌雄各半，16周齡，體質(zhì)量（216±18）g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2018-0003；動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0012，動物質(zhì)量合格證號：NO6014587。動物飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（22±1）℃。

1.2 試藥與儀器 健心湯，組成：生地黃10 g，麥冬10 g，桂枝9 g，炙甘草3 g，黨參10 g，苦參9 g，甘松5 g，丹參9 g，紫石英10 g，板藍(lán)根6 g。藥材加水浸泡1 h，水煎30 min，煎2次，合并濾液濃縮成生藥質(zhì)量濃度1 g/mL的藥液備用。異丙腎上腺素（美國Sigma公司，批號：56241）；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號：B0807、B0716）；去DNA離子水（DN-ase，美國Invitrogen公司，批號R551679）；SYBR-Green試劑（美國Applied Biosystems公司，批號A5089）；NP-40裂解緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所，批號181129）；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒、聚偏二氟乙烯膜（美國賽默飛世爾科技公司，批號ZX6351、ZX5017）；聚丙烯酰胺凝膠、吐溫-20（Tween-20）（美國sigma公司，批號L2880、L1248）；GATA-4蛋白一抗、GAPDH的一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（美國Abcam公司，批號ab23053、ab8245、ab6728）；ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀、Vivid 7 Dimension彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE公司）；ABI 7900熱循環(huán)儀（美國ABI公司）；奧林巴斯SZX7顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 分組與造模[10]大鼠隨機(jī)分成7組：空白對照組、模型組、運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組，每組20只。除空白對照組外，其余各組以2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，于左胸部三、四肋間開胸，鈍性分離皮膚肌肉，安置開胸器，擴(kuò)大手術(shù)視野，暴露心臟，打開心包膜，與右心室流出道和左心耳之間下約2 mm處以5-0無創(chuàng)絲線結(jié)扎左冠狀動脈，可見前降支供血區(qū)迅速變蒼白，同時(shí)ST段顯著抬高或兩個(gè)以上導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)抬高＞0.2 mV，說明手術(shù)成功，快速置心臟于胸腔，并立即縫合胸壁。術(shù)后24 h各組大鼠腹腔注射3 mg/kg異丙腎上腺素。以左室射血分?jǐn)?shù)小于60%為成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 干預(yù)方法 各組大鼠成模后24 h給予相應(yīng)藥物?？瞻讓φ战M及模型組按1 mL/100 g灌胃生理鹽水。依普利酮組予依普利酮藥液10 mg/kg灌胃（預(yù)實(shí)驗(yàn)得出依普利酮對心衰大鼠的LC50為20 mg/kg，以1/2 LC50為作用劑量）。健心湯組予健心湯10 g/kg灌胃（預(yù)試驗(yàn)求出健心湯對心衰大鼠的LC50為20 g/kg，以1/2 LC50為作用劑量），均每日1次，連續(xù)8周。運(yùn)動組進(jìn)行跑臺訓(xùn)練：即5 min熱身（坡度為0，速度為5 m/min）后，坡度調(diào)為5°，速度為10 m/min，第1天訓(xùn)練15 min，第2天30 min，第3天45 min，從第4天開始均為60 min。每周訓(xùn)練5 d，共訓(xùn)練8周。依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組給藥方法及運(yùn)動訓(xùn)練同上。

1.5 超聲心動指標(biāo)的測定 各組大鼠給藥結(jié)束后，應(yīng)用Vivid 7 Dimension彩色多普勒超聲診斷儀測定射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）。

1.6 大鼠心肌病理觀察 處死各組大鼠取心肌組織，常規(guī)脫水、包埋、切片，HE染色、中性樹膠封固，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）測定大鼠心肌GATA-4基因水平 用TRIzol試劑從大鼠心肌組織提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在37℃下30 min將總共1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)制造商的方案，添加 20 μL DNase去除基因組 DNA。使用 5 μL SYBR-Green試劑在ABI 7900熱循環(huán)儀中以10 μL的體積進(jìn)行qPCR，該試劑盒由1 μL cDNA（1∶50稀釋度）和2 μL正向和反向引物（1 mmol/L）構(gòu)成。引物由碧云天生物技術(shù)研究所合成。引物的設(shè)計(jì)如下：GATA-4正向 5′-GCTCGTGGCTTAGGAGATTG-3′，和反向 5′-CTGGCAAAGCATGAGGAACT-3′；GAPDH 正 向 5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，和反向 5′-AGTC TTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。PCR循環(huán)條件如下：95 ℃ 5 min、75 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。GATA-4的相對表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

1.8 Western blotting測定大鼠心肌GATA-4蛋白表達(dá)水平 NP-40裂解緩沖液提取心肌組織總蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。將等體積的50 μg蛋白質(zhì)上樣到每個(gè)孔中，并用10%聚丙烯酰胺凝膠分離，然后將聚偏二氟乙烯膜用于免疫印跡，室溫下將膜在5%牛奶中封閉1 h，然后將一抗在4℃孵育過夜，用吐溫-20的Tris緩沖鹽水洗滌30 min后，將二抗在室溫下孵育1 h。GAPDH用作內(nèi)部對照，GATA-4蛋白一抗稀釋比例為1∶1 000?？笹APDH的一抗和二抗（辣根過氧化物酶偶聯(lián)），稀釋比例為1∶1 000。免疫反應(yīng)性通過使用ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影來確定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心力衰竭大鼠心功能指標(biāo)比較 見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs水平升高（P＜0.05），F(xiàn)S、EF水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs水平降低（P＜0.05），F(xiàn)S、EF水平升高（P＜0.05）。與運(yùn)動組比較，依普利酮組、健心湯組LVIDd、LVIDs水平降低（P＜0.05），F(xiàn)S、EF水平升高（P＜0.05），且依普利酮組、健心湯組LVIDd、LVIDs、FS、EF水平相近（P＞0.05）。依普利酮+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs水平分別低于依普利酮組、運(yùn)動組（P＜0.05），F(xiàn)S、EF水平分別高于依普利酮組、運(yùn)動組（P＜0.05）；健心湯+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs水平分別低于健心湯組、運(yùn)動組（P＜0.05），F(xiàn)S、EF水平分別高于健心湯組、運(yùn)動組（P＜0.05）；依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組 LVIDd、LVIDs、FS、EF水平相近（P＞0.05）。

表1 各組心力衰竭大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組心力衰竭大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05；與運(yùn)動組比較，#P＜0.05；與依普利酮組比較，△P＜0.05；與健心湯組比較，▲P＜0.05。下同

組 別n LVIDd（mm）LVIDs（mm）FS（%）EF（%）空白對照組模型組運(yùn)動組依普利酮組健心湯組依普利酮+運(yùn)動組健心湯+運(yùn)動組20 20 20 20 20 20 20 5.21±0.42*7.83±0.65 7.16±0.66*6.65±0.55*#6.60±0.64*#5.95±0.56*#△5.93±0.62*#▲2.37±0.76*7.12±0.85 6.45±0.84*5.94±0.96*#5.93±0.59*#4.36±0.71*#△4.40±0.69*#▲49.32±1.63*27.14±1.54 29.69±1.91*34.18±1.97*#34.19±1.69*#43.63±1.56*#△43.99±1.59*#▲79.63±1.64*41.24±1.67 46.39±1.85*51.56±1.56*#51.49±1.38*#65.96±1.86*#△64.65±1.75*#▲

2.2 各組心力衰竭大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)的改變 見圖1?？瞻讓φ战M心肌結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰、肌纖維排列整齊，肌纖維未見空白、斷裂及缺損區(qū)。模型組心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細(xì)胞相互交織，肌原纖維排列紊亂、斷裂及缺失，炎癥細(xì)胞浸潤明顯。運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組心肌纖維排列較為整齊，炎癥細(xì)胞浸潤減少。依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組心肌細(xì)胞組織形態(tài)基本正常。

圖1 各組心力衰竭大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)的改變（HE染色，400倍）

2.3 各組心力衰竭大鼠心肌GATA-4 mRNA表達(dá)比較 見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠GATA-4 mRNA水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA水平降低（P＜0.05）。與運(yùn)動組比較，依普利酮組、健心湯組GATA-4 mRNA水平降低（P＜0.05），且依普利酮組、健心湯組GATA-4 mRNA水平相近（P＞0.05）。依普利酮+運(yùn)動組GATA-4 mRNA水平分別低于依普利酮組、運(yùn)動組（P＜0.05）。健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA水平分別低于健心湯組、運(yùn)動組（P＜0.05）；依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA水平相近（P＞0.05）。

表2 各組心力衰竭大鼠心肌GATA-4 mRNA、GATA-4蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組心力衰竭大鼠心肌GATA-4 mRNA、GATA-4蛋白表達(dá)比較（±s）

組別空白對照組模型組運(yùn)動組依普利酮組健心湯組依普利酮+運(yùn)動組健心湯+運(yùn)動組n 20 20 20 20 20 20 20 GATA-4 mRNA 0.87±0.45*6.54±0.46 4.36±0.63*3.65±0.48*#3.69±0.53*#2.41±0.50*#△2.39±0.49*#▲GATA-4蛋白1.23±0.56*7.32±0.56 5.36±0.56*4.21±0.65*#4.19±0.53*#3.65±0.59*#△3.69±0.55*#▲

2.4 各組心力衰竭大鼠心肌GATA-4蛋白水平比較見表2，圖2。與空白對照組比較，模型組大鼠GATA-4蛋白水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4蛋白水平降低（P＜0.05）。與運(yùn)動組比較，依普利酮組、健心湯組GATA-4蛋白水平降低（P＜0.05），且依普利酮組、健心湯組GATA-4蛋白水平相近（P＞0.05）。依普利酮+運(yùn)動組GATA-4蛋白水平分別低于依普利酮組、運(yùn)動組（P＜0.05）。健心湯+運(yùn)動組GATA-4蛋白水平分別低于健心湯組、運(yùn)動組（P＜0.05）。依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4蛋白水平相近（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠心肌GATA-4蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明，健心湯可減少冠心病患者心臟重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。最近的一項(xiàng)回顧性研究顯示，健心湯可降低缺血性心力衰竭患者的心臟死亡率[11]。研究表明，健心湯具有血管舒張的雙重機(jī)制，健心湯通過刺激血管平滑肌細(xì)胞中的鳥苷酸環(huán)化酶充當(dāng)硝酸酯[12]。這會導(dǎo)致大冠狀動脈（導(dǎo)致血流量增加）和靜脈（導(dǎo)致心臟預(yù)緊力降低）的擴(kuò)張。此外健心湯是一種ATP敏感的KATP通道開放劑，可在血管平滑肌和線粒體中引起K外排。它使細(xì)胞超極化，使電壓門控的鈣通道失活，并減少游離的細(xì)胞內(nèi)Ca2+。這導(dǎo)致小冠狀動脈和阻力血管松弛，增加了流向心肌的血液。健心湯擴(kuò)大了全身阻力和容量血管，減少了心臟的前負(fù)荷和后負(fù)荷以及心肌耗氧量。健心湯還可以緩解冠狀動脈痙攣，增加側(cè)支循環(huán)和心內(nèi)膜下血供。定期的體育鍛煉與心肌灌注和新陳代謝增加以及交感-副交感神經(jīng)平衡正常化密切相關(guān)，后者可降低氧化應(yīng)激。此外，體育鍛煉可能與改善心肌鈣的處理有關(guān)。一項(xiàng)動物研究發(fā)現(xiàn)，在跑步機(jī)運(yùn)動訓(xùn)練8周后，心力衰竭大鼠的骨骼肌中白介素10（IL-10）/TNF-α的比例有所改善；這些改善導(dǎo)致TNF-α的降低和IL-10的升高[13]。作為對低灌注的反應(yīng)，局部炎癥過程似乎開始于外周骨骼肌，而活性氧的增加可能導(dǎo)致全身（血漿）促炎性分布增加。本次研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs水平升高，F(xiàn)S、EF水平降低；與模型組比較，依普利酮組、健心湯組、運(yùn)動組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs降低，F(xiàn)S、EF升高；與運(yùn)動組比較，依普利酮組、健心湯組LVIDd、LVIDs降低，F(xiàn)S、EF升高，且依普利酮組、健心湯組LVIDd、LVIDs、FS、EF相近；依普利酮+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs低于依普利酮組、運(yùn)動組，F(xiàn)S、EF高于依普利酮組、運(yùn)動組；健心湯+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs低于健心湯組、運(yùn)動組，F(xiàn)S、EF高于健心湯組、運(yùn)動組；依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組LVIDd、LVIDs、FS、EF相近。說明運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯能改善大鼠心力衰竭程度，其效果優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)動訓(xùn)練、健心湯作用。病理學(xué)結(jié)果顯示，對照組心肌結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰、肌纖維排列整齊，肌纖維未見空白、斷裂及缺損區(qū)；模型組心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細(xì)胞相互交織，肌原纖維排列紊亂、斷裂及缺失，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；運(yùn)動組、依普利酮組、健心湯組心肌纖維排列較為整齊，炎癥細(xì)胞浸潤減少。依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組心肌細(xì)胞組織形態(tài)基本正常。這與上述結(jié)論一致。

最近的體內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)GATA-4過表達(dá)對心臟具有損害保護(hù)作用。GATA-4對柔紅霉素或阿霉素凋亡的刺激（例如用Caspase進(jìn)行治療）表現(xiàn)出的活性上調(diào)[14]。GATA-4等位基因無效的雜合子小鼠降低了細(xì)胞凋亡，并顯示出對阿霉素治療的心臟毒性反應(yīng)顯著減弱。此外，過表達(dá)GATA-4第二外顯子的雜合子小鼠因壓力超負(fù)荷而出現(xiàn)適應(yīng)不良性肥大[15-16]?；谙俨《镜腉ATA-4抑制可保護(hù)心肌細(xì)胞免受藥物誘導(dǎo)的凋亡，而GATA-4蛋白的細(xì)胞間抑制已顯示可改善缺血性心肌病的心臟功能。在胚胎發(fā)育，出生后生長和成年期，GATA-4在心肌細(xì)胞中高度表達(dá)，在此期間，它起著心臟分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的作用[17-18]。本次試驗(yàn)通過RT-PCR法及western blotting法探討了大鼠心肌GATA-4 mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠GATA-4 mRNA和蛋白水平升高；與模型組比較，依普利酮組、健心湯組、運(yùn)動組、依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA和蛋白水平降低；與運(yùn)動組比較，依普利酮組、健心湯組GATA-4 mRNA和蛋白水平降低，且依普利酮組、健心湯組GATA-4 mRNA和蛋白水平相近；依普利酮+運(yùn)動組GATA-4 mRNA和蛋白水平低于依普利酮組、運(yùn)動組；健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA和蛋白水平低于健心湯組、運(yùn)動組；依普利酮+運(yùn)動組、健心湯+運(yùn)動組GATA-4 mRNA和蛋白水平相近。這說明，運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯能明顯抑制心力衰竭大鼠心臟GATA-4基因及蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯能改善大鼠心力衰竭程度，其效果優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)動訓(xùn)練或健心湯作用，其機(jī)制可能與運(yùn)動訓(xùn)練聯(lián)合健心湯抑制心力衰竭大鼠心臟GATA-4基因及蛋白表達(dá)水平有關(guān)。