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    電項(xiàng)針干預(yù)對(duì)腦出血大鼠急性期腦組織中血紅素加氧酶-1表達(dá)及神經(jīng)損傷的影響?

    2020-06-15 02:08:54柳依江沈詩(shī)彥杜若桑張曉輝邵文娜
    中國(guó)中醫(yī)急癥 2020年5期
    關(guān)鍵詞:針組造模腦組織

    柳依江 沈詩(shī)彥 杜若桑 張曉輝 邵文娜 崔 ?!?/p>

    (1.首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069;2.浙江省杭州市杭州種福堂中醫(yī)醫(yī)院,浙江 杭州 310011)

    腦出血是一種嚴(yán)重的,有著高死亡率和不良預(yù)后的卒中類(lèi)型[1-4]。在我國(guó),相比30年前的同類(lèi)調(diào)查,腦出血流行狀況十分嚴(yán)峻,其患病率、發(fā)病率大幅上升,為患者及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[5],其病理過(guò)程主要為血液在腦實(shí)質(zhì)中快速蓄積,導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦組織損傷[6]。腦出血致死的患者中,近半數(shù)出現(xiàn)在出血后2 d內(nèi)[7],其中,血腫源性毒性產(chǎn)物、氧化應(yīng)激反應(yīng)和促炎性反應(yīng)在繼發(fā)性損傷過(guò)程中起到重要作用[8-11]。

    血紅素加氧酶-1(HO-1)及其代謝產(chǎn)物的活性能對(duì)氧化損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等生物過(guò)程起關(guān)鍵作用[12-13]。已有研究表明,藥物激活HO-1活性能夠調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制水腫進(jìn)展,減輕早期腦損傷,給予抑制劑組則損傷加重[14]。本實(shí)驗(yàn)以HO-1表達(dá)為關(guān)注點(diǎn),通過(guò)觀察腦出血急性期腦組織中含量變化,探討電項(xiàng)針干預(yù)對(duì)腦出血大鼠繼發(fā)性損傷的治療作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    30只SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,體質(zhì)量(300±20)g。分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房屏障環(huán)境,光照周期為12 h模擬晝夜交替,溫度為(23±2)℃,自由飲水,SPF級(jí)飼料喂養(yǎng),合格證號(hào):SCXK(京)2016-0011。

    1.2 試藥與儀器

    鋅原卟啉-9(ZPP-Ⅸ)(美國(guó) Frontier Scientific),qPCR試劑盒(美國(guó)KAPA Biosystems),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。桌面數(shù)顯腦立體定位儀(深圳RWD Life Science),華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),分析天平(德國(guó)Sartorius),高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司),實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI),分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司),電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

    1.3 分組與造模

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組,假手術(shù)組、模型組、電項(xiàng)針組、ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組。實(shí)驗(yàn)采用自體血注入尾狀核形成血腫,制備自體血腦出血模型[15]。操作步驟:使用20%烏拉坦(7 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,俯臥位固定于腦立體定位儀上,頭部備皮,常規(guī)消毒后沿正中線切開(kāi)約1 cm,確定前囟位置,根據(jù)大鼠腦定位圖譜確定右側(cè)尾狀核位置(前囟右3 mm,后0.2 mm)[16],使用牙科鉆打孔(d=1 mm),深度至硬腦膜且不傷及腦實(shí)質(zhì)。用1 mL注射器尾靜脈抽取約100 μL,轉(zhuǎn)移到100 μL微量注射器后固定在定位儀上。微量注射器垂直方向緩慢進(jìn)針,深度為5.5 mm,以5 μL/min速度勻速泵入50 μL血液,注射后留針10 min,緩慢退針。骨蠟封閉骨孔,縫合皮膚并消毒。ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組在造模后30 min腹腔注射ZPP-Ⅸ(質(zhì)量濃度10 mg/mL,劑量10 mg/kg)。假手術(shù)組除不注入自體血外,其余操作同模型組。造模1 d后,使用Longa評(píng)分[17]對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià),評(píng)分大于1分可認(rèn)為造模成功,則納入實(shí)驗(yàn),否則剔除。數(shù)量不足則根據(jù)隨機(jī)分配補(bǔ)齊并造模。

    1.4 干預(yù)方法

    根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選擇供血(頸4夾脊穴)、風(fēng)池給予電項(xiàng)針干預(yù)[18]。常規(guī)消毒后使用毫針進(jìn)針3 mm,華佗電子針療儀正極接風(fēng)池,負(fù)極接供血。選擇疏波,頻率1 Hz,留針30 min。電項(xiàng)針組和ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組造模后連續(xù)3 d給予干預(yù),其他組不干預(yù)。

    1.5 檢測(cè)指標(biāo)

    1.5.1 腦組織HO-1 mRNA測(cè)定 造模后第3天給予麻醉并斷頭取腦,保存于-80℃。選擇血腫周?chē)M織,取100 mg使用試劑盒提取樣本總RNA。檢索HO-1核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。引物合成反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增,進(jìn)行 Real-time PCR 檢測(cè),采用 2(-ΔΔCt)值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。引物序列信息見(jiàn)表1。

    表1 目的基因引物序列

    1.5.2 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 使用Longa評(píng)分[17]對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。0分:未見(jiàn)任何神經(jīng)損傷癥狀。1分:病灶對(duì)側(cè)前肢或后肢不能伸直。2分:行走時(shí)偏向患側(cè)偏轉(zhuǎn)。3分:行走過(guò)程向患側(cè)傾倒不能站立。4分:不能行走且有意識(shí)障礙。

    1.5.3 腦組織含水量測(cè)定 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材,將用于測(cè)量含水量的腦組織用分析天平秤質(zhì)量,得到濕質(zhì)量;置于烘箱內(nèi)用60℃烘干48 h以上,多次稱(chēng)量至質(zhì)量不再減少,得到干質(zhì)量。腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用GraphPad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以()表示,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)采用LSD分析,方差不齊時(shí)采用Dunnettt檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA含量比較

    見(jiàn)表2。相較于假手術(shù)組,其他各組HO-1 mRNA表達(dá)均顯著增加,并且電項(xiàng)針組HO-1表達(dá)高于模型組(P<0.01)。給予抑制劑后,ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組較假手術(shù)組HO-1均有增高,但組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達(dá)比較(2-ΔΔCt,±s)

    表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達(dá)比較(2-ΔΔCt,±s)

    與假手術(shù)組比較,?P <0.05,??P < 0.01;與模型組比較,△P< 0.05,△△P<0.01。下同

    組別HO-1 mRNA n假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組0.578±0.099 1.618±0.328**2.805±0.357**△△1.103±0.220**1.345±0.229**6 6 6 6 6

    2.2 各組大鼠腦含水量比較

    見(jiàn)表3。造模1 d后大鼠腦含水量增高,在第3日腦含水量增高明顯。相較同時(shí)段假手術(shù)組,各組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1 d時(shí)電項(xiàng)針組腦組織含水量低于模型組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在3 d時(shí)電項(xiàng)針組含水量增高,但仍低于模型組(P<0.05)。在抑制劑干預(yù)兩組中,兩時(shí)間點(diǎn)ZPP-Ⅸ模型組腦組織含水量均高于ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組(P<0.05)。

    表3 各組大鼠腦含水量比較(%,±s)

    表3 各組大鼠腦含水量比較(%,±s)

    與ZPP-Ⅸ模型組比較,#P<0.05。下同

    組別假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組3 d 72.96±0.387 81.57±0.815*78.62±0.520*△82.32±0.738*79.78±0.252*#n3 3 3 3 3 1 d 72.85±0.652 78.01±0.510*77.73±0.854*78.49±0.366*78.29±0.291*#

    2.3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 見(jiàn)表4。造模后1 d對(duì)比假手術(shù)組,各組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯增高(P<0.05),第3天神經(jīng)功能評(píng)分較第1天有升高。對(duì)比ZPP-Ⅸ模型組,ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組神經(jīng)功能評(píng)分改善(P<0.05)。模型組與電項(xiàng)針組比較仍可見(jiàn)神經(jīng)功能損傷改善趨勢(shì)(P>0.05)。

    表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較(分,±s)

    表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較(分,±s)

    組別假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組n6 6 6 6 6 1 d 0.167±0.408 1.667±0.211*1.000±0.408*△2.000±0.258*1.167±0.167*#3 d 0.333±0.516 2.500±0.224 1.667±0.334 2.833±0.167 1.500±0.342#

    3 討 論

    中醫(yī)理論認(rèn)為頭為諸陽(yáng)之會(huì),六陽(yáng)經(jīng)交接于頭部,督脈和足太陽(yáng)經(jīng)直接絡(luò)于腦,其他陽(yáng)經(jīng)與督脈交會(huì)于大椎穴,故通過(guò)刺激頸部穴位,激發(fā)陽(yáng)氣達(dá)到活血化瘀的目的。實(shí)驗(yàn)中選取的供血(頸4夾脊穴)、風(fēng)池兩穴位于椎動(dòng)脈上方,通過(guò)疏波刺激調(diào)節(jié)椎基底動(dòng)脈、Willis環(huán)的血流,進(jìn)而改善出血后腦功能。臨床上,給予電項(xiàng)針干預(yù)能夠通過(guò)改善血流供應(yīng)、降低血液黏稠度、減緩急性期腦水腫發(fā)展等來(lái)治療腦出血,并對(duì)認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)功能損傷癥狀有明顯改善[19-22]。

    HO-1是血紅素分解成一氧化碳、鐵和膽綠素過(guò)程中的限速酶,可以在血紅素、重金屬、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等多種刺激物作用下高度上調(diào)。腦出血后,高濃度游離的血紅素能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增高,加速血紅素分解,減少自由基產(chǎn)生,減輕繼發(fā)性損傷。HO-1還可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞防止凋亡,也可以調(diào)節(jié)血管緊張度,使血管松弛,減輕血管壁炎癥反應(yīng),同時(shí)還能夠參與血管生成[23-24]。有研究表明腦出血后,紅細(xì)胞溶解釋放血紅素,會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)能量?jī)?chǔ)備、激活補(bǔ)體系統(tǒng)[25],進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)元死亡[26]。腦出血后高濃度的游離血紅素則促使HO-1表達(dá)升高,使血紅素分解減輕繼發(fā)性損傷。

    臨床研究表明,腦出血后3 d內(nèi)HO-1表達(dá)達(dá)到高峰,且與急性期損傷同步[27],該過(guò)程與大鼠腦出血模型研究相一致[28]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腦出血后血腫周?chē)M織HO-1表達(dá)升高同時(shí),與TNF-α、IL-1β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),能夠發(fā)揮抗炎作用[29]。戴曉紅等研究表明,給予腦出血大鼠頭針干預(yù)能夠上調(diào)病灶周?chē)鶫O-1表達(dá),發(fā)揮其抗氧化作用,減輕損傷[30]。

    本實(shí)驗(yàn)中,與假手術(shù)組對(duì)比,各組HO-1表達(dá)均增高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,電項(xiàng)針干預(yù)后HO-1表達(dá)較模型組增高。在給予ZPP-Ⅸ抑制劑的兩組中未見(jiàn)差異,說(shuō)明電項(xiàng)針能夠通過(guò)提高HO-1水平來(lái)改善出血后損傷。通過(guò)腦含水量的測(cè)定表明,給予電項(xiàng)針干預(yù)的兩組均能夠抑制腦水腫的發(fā)展,并且作用途徑不僅限于HO-1通路。神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分,表明電項(xiàng)針干預(yù)能夠改善神經(jīng)功能缺損,電項(xiàng)針與模型組對(duì)比雖然差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但可見(jiàn)評(píng)分降低,需進(jìn)一步研究論證。

    綜上,本實(shí)驗(yàn)表明電項(xiàng)針可以提高HO-1表達(dá),抑制腦水腫進(jìn)展,減輕腦出血后繼發(fā)性損傷,并且能夠改善神經(jīng)功能損傷,其具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

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