中性粒細胞彈性蛋白酶及與疾病的關(guān)系研究進展

趙曰霞 鄧莉

中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是中性粒細胞分泌的主要絲氨酸蛋白酶之一[1]。NE在機體的生理和病理過程中具有重要作用，一方面NE參與構(gòu)成機體防御系統(tǒng)，協(xié)助清除病原微生物；另一方面，NE過度激活，在與內(nèi)源性抑制劑之間失衡的情況下，直接參與組織損傷,與多種炎癥相關(guān)疾病，如動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)，肺囊腫性纖維化(cystic fibrosis，CF)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可作為這些疾病的防治靶點。本文對 NE及其在相關(guān)炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行綜述和探討，以期為以 NE 為靶點的藥物開發(fā)與應(yīng)用提供新視野。

1 NE的基本特性

1.1 NE的結(jié)構(gòu) NE是一種可溶性糖蛋白,由218個氨基酸殘基組成，其三維結(jié)構(gòu)是2 個 β桶結(jié)構(gòu)形成的折疊,而每個β桶結(jié)構(gòu)又包括6個反向平行的β折疊。其催化活性位點由天冬氨酸(asparagicacid，Asp)、組氨酸(histidine，His)、絲氨酸(serine，Ser)組成，位于2個β桶結(jié)構(gòu)的連接處。NE 還含有天冬酰胺(asparagine,Asn)109 和 Asn159 兩個糖基化位點，S1位點是半球形和疏水的，在確定NE底物特異性中起重要作用。NE以無活性的酶原形式合成，經(jīng)過廣泛的蛋白水解加工和翻譯后修飾，才能轉(zhuǎn)化為它的成熟形式，含有4對半胱氨酸殘基形成的4對分子內(nèi)二硫鍵，以維系分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

1.2 NE的分布與表達 編碼NE的ELA2/ELANE基因(以前稱為ELA2，新稱為ELANE)在早幼粒細胞階段中高度表達。ELA2/ELANE基因的表達主要在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平上受到嚴格控制。中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒是NE的主要存儲部位，NE還可存在于核膜[2]以及由細胞因子激活的細胞表面。未激活的中性粒細胞膜上也有 NE表達，活化的中性粒細胞膜表達的 NE(membrane-bound elastase,mNE)是未活化的20 倍[2,3]。此外，巨噬細胞、平滑肌細胞和肥大細胞也可表達NE[4]。巨噬細胞不僅在生理條件下表達NE，也可以在某些病理條件下誘導(dǎo)合成NE[4]。

當(dāng)中性粒細胞被細胞因子、細菌脂多糖、細胞松弛素B、佛波醇酯、鈣離子載體等激活時,NE分泌到細胞外，約10%的NE與質(zhì)膜外表面相結(jié)合[5]。NE能結(jié)合在細胞膜上，主要與含硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素的蛋白聚糖(HSPG和CSPG)的硫酸基團的靜電相互作用有關(guān)[6]。當(dāng)活化的中性粒細胞進入彈性蛋白酶依賴的程序性細胞死亡過程(NETosis)，其中NE易位至細胞核并與DNA和組蛋白蛋白質(zhì)經(jīng)歷縮合[7]。見表1。

表1 NE的分布與表達

2 NE的生物學(xué)功能

2.1 NE的抗菌活性 NE通過細胞內(nèi)和細胞外兩條途徑有效的殺死革蘭陰性菌如大腸埃希菌、腸道沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和福氏志賀菌等，但對革蘭陽性菌作用不明顯。NE與髓過氧化物酶和由NADPH氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)組合，直接細胞內(nèi)殺死吞噬溶酶體中的吞噬細菌。 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps,NETs)是由中性粒細胞釋放至細胞外的包含有NE在內(nèi)的蛋白酶、DNA、組蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以捕獲并清除病原菌，從而防止進一步擴散[8]。NETs中的NE在細胞外通過降解細菌毒力因子發(fā)揮其對革蘭氏陰性菌的抗菌活性。此外，NE表面所帶的正電荷介導(dǎo)其與細菌膜緊密結(jié)合，進而抑制細菌蛋白質(zhì)合成并誘導(dǎo)膜去極化和破壞，在細胞外抗菌活性中發(fā)揮重要的作用[6]。

2.2 NE降解多種組織蛋白 NE具有廣泛的底物特異性，不僅能特異性降解彈性蛋白，還能降解粘連蛋白、層粘連蛋白、 Ⅰ～Ⅳ型膠原蛋白、Ⅵ型膠原蛋白、Ⅹ型膠原蛋白、鈣黏蛋白、蛋白多糖等多種細胞外基質(zhì)以及血漿成分免疫球蛋白。在一定條件下可能水解肺、動脈、皮膚、韌帶等組織從而引起一系列疾病。

2.3 NE對炎癥過程的調(diào)控作用

2.3.1 對細胞因子的加工作用:NE可激活和加工腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8等促炎細胞因子，其中IL-1成員包括IL-1β、IL-18、IL-33和IL-36細胞因子，而IL-1β和IL-18促進TNF-α和IL-6的釋放，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。

2.3.2 對細胞受體的調(diào)控:NE可通過加工細胞受體調(diào)控細胞信號傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。NE 通過裂解蛋白酶激活受體(protease activated receptor，PAR)-1,解除凝血酶激活的鈣信號，而這種 G 蛋白偏置信號能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞屏障的完整性，誘導(dǎo)上皮細胞凋亡[9]；NE通過PAR-2依賴性機制誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)炎癥和疼痛[10,11]；NE可以激活Toll樣受體4(TLR4)，而TLR4是TLR家族的關(guān)鍵成員，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性物質(zhì)；NE通過激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)參與TLR4的反式激活，其被NE激活后可上調(diào)IL-8的產(chǎn)生，在調(diào)控炎癥過程中起重要作用[12]。

2.3.3 對其他物質(zhì)的調(diào)控:NE通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9以及使金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)失活，使蛋白水解平衡向有利于基質(zhì)分解的方向變化[13]。NE通過增加上皮細胞的MMP-2表達，可能導(dǎo)致CF中重構(gòu)和炎性反應(yīng)增加。MMP-9通過產(chǎn)生PGP和增加IL-8的趨化因子效力發(fā)揮促炎作用[14]，NE通過裂解活化MMP-9參與CF、COPD等炎癥性疾病。TIMPs被認為是MMPs最具特異性的內(nèi)源性抑制劑，NE通過特異性切割TIMPs使其降解失活，使MMPs/TIMPs失衡，進而導(dǎo)致炎癥的加劇。NE激活鈣蛋白酶，鈣蛋白酶能夠切割E-cad，干擾其細胞-細胞黏附功能，破壞上皮細胞，參與肺炎癥和組織破壞性疾病[15]。NE可以切割和修飾某些低密度脂蛋白(LDL)，增強了動脈壁細胞(特別是巨噬細胞)對它們的攝取，導(dǎo)致細胞膽固醇積聚和泡沫細胞形成[16]。

從前述可知，HNE生物學(xué)功能廣泛，可以通過不同的機制調(diào)節(jié)全身和局部免疫應(yīng)答和(或)炎癥，影響細胞和組織功能，參與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。

3 NE抑制劑

3.1 內(nèi)源性NE抑制劑 具有抗NE活性的內(nèi)源性抑制劑包括α-1蛋白酶抑制劑(AAT，α1-PI)，elafin， SLPI，α2-巨球蛋白(alpha 2-macroglobulin，α2-M)和單核細胞NE抑制劑(MNEI或SerpinB1)。 NE的活性主要受AAT，Serpin B1和SLPI的調(diào)節(jié)。 AAT主要在肝臟中合成，但也在肝外組織和細胞中表達，包括支氣管上皮細胞，單核吞噬細胞和中性粒細胞以及癌細胞,可以被活性氧物質(zhì)(ROS)滅活，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)成分降解，與彈性蛋白酶依賴性組織損傷的加劇，細胞死亡和自身抗原的釋放，炎癥惡化有關(guān)[17-21]。SerpinB1 是由巨噬細胞、上皮細胞、中性粒細胞產(chǎn)生的一種 HNE 強效抑制劑。它不分泌到細胞外環(huán)境中，保留在細胞質(zhì)和初級顆粒內(nèi)。SLPI是可由上皮細胞，肥大細胞，中性粒細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，是保守性NE抑制劑[10]。 SLPI在受到炎性刺激時上調(diào)，通過抑制絲氨酸蛋白酶來控制炎癥，減弱單核細胞/巨噬細胞對LPS的反應(yīng)，阻止轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，防止細菌，真菌和病毒感染。Elafin的主要底物是NE和蛋白酶-3，通過競爭性緊密結(jié)合機制起作用。NE和elafin水平之間的不平衡與ARDS死亡率相關(guān)。SLPI和elafin被歸類為報警抑制劑，因為它們是響應(yīng)于細胞因子的釋放而產(chǎn)生并直接釋放到上皮細胞中，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥過程[17]。α2-M 是大小為 725 kU的血漿糖蛋白，因其分子質(zhì)量大，較難能到達炎癥部位。它對酶抑制作用的發(fā)揮可能就局限于循環(huán)血液中，只有當(dāng)血管通透性大大增加的時候才能游離到其他部位發(fā)生作用。

生理情況下NEI 和 NE 保持平衡狀態(tài)，從而抑制 NE 對組織、細胞的損傷作用。但在炎癥或感染時，NE也可通過有限的顆粒胞吐作用釋放到細胞外。盡管細胞外存在內(nèi)源性抑制劑，但 NE 釋放到細胞外后仍然保持活性。NE 有多種機制抵抗內(nèi)源性抑制劑的作用：(1)NE通過結(jié)合α-2巨球蛋白或聚陰離子結(jié)合配偶體(如硫酸乙酰肝素、NETs中的DNA)使其免受抗蛋白酶的作用[21];(2)中性粒細胞在活化后產(chǎn)生的大量氧自由基、MMPs可使 α1-PI、α2-M 失活[22]；(3)活化的中性粒細胞周圍存在專性NE活性區(qū)域，其中釋放的NE的局部濃度高于抗蛋白酶的表觀濃度；(4)NE與其底物緊密接觸，阻止 NEI 的抑制作用;(5)當(dāng)細菌不能從CF患者的氣道中有效清除，細菌蛋白酶可降解抗蛋白酶；(6)環(huán)境(煙草煙霧，空氣污染)或遺傳(AATD)因子可進一步降低患者的有效抗蛋白酶濃度。NE 和 NEI 的失衡在很多疾病的進展中具有關(guān)鍵作用。

3.2 外源性抑制劑 目前已知的只有兩種藥物可用于臨床：Prolastin(純化的a1-AT)，一種通過重組DNA技術(shù)合成的多肽藥物，用于治療a1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AATD)；另一種是非肽類低分子量化合物Sivelestat，屬于第二代HNE抑制劑[17]。AZD9668 (Alvelestat,Astra Zeneca) and BAY 85-8501 (Bayer Health Care) 是兩種有效的HNE抑制劑，分別屬于第三代和第五代HNE抑制劑，最近已達到COPD、CF和BE臨床試驗水平的第二階段[17]。AZD9668是人NE的可逆和選擇性抑制劑，兩項Ⅱb RCT研究了AZD9668對有癥狀COPD患者的惡化頻率，癥狀，肺功能和炎癥生物標(biāo)志物的影響[23,24]。盡管有良好的安全性和耐受性數(shù)據(jù)，但兩項試驗均未顯示任何陽性結(jié)果。AZD9668在CF的隨機，雙盲，安慰劑對照，平行組，Ⅱa期研究中進行了一系列測試，其有良好的耐受性并且顯著減少了痰炎癥生物標(biāo)志物(IL-6，正常T細胞表達)以及減少了游離和總尿液desmosine(彈性蛋白降解的生物標(biāo)志物)[25]。

4 NE與疾病

NE不僅直接降解組織蛋白，還通過調(diào)控炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種機制，導(dǎo)致組織損傷和重構(gòu)，參與 AS、COPD 和 PF 等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

4.1 AS AS是常見的慢性血管性炎癥疾病，炎癥、免疫反應(yīng)在AS的形成及AS斑塊進展為不穩(wěn)定斑塊的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[26]。NE存在于AS斑塊內(nèi)[27],不僅直接降解細胞外基質(zhì)，還通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡影響AS斑塊的穩(wěn)定性。彈性蛋白酶誘導(dǎo)自噬-凋亡形式的內(nèi)皮細胞死亡的劑量和劑量依賴性方式，與C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)的磷酸化/表達的顯著增加相關(guān)。Glinzer等[28]通過使用CHOP敲低，確定CHOP是彈性蛋白酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)。此外，NE還能促進泡沫細胞生成并增加局部/全身炎癥。NE通過增強ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白ABCA1蛋白的降解來抑制膽固醇流出，增加巨噬細胞中脂質(zhì)積累，促進泡沫細胞的形成。這反過來導(dǎo)致更高水平的局部和全身炎癥，并最終增加動脈粥樣硬化。NE缺陷小鼠中，多種促炎細胞因子(例如，TNF-α，IFN-c，IL1b，IL-8和IL-12)的循環(huán)和主動脈表達水平均顯著降低，表明NE通過啟動這些促炎性細胞因子促進AS形成[29]。NE被認為是AS的治療靶點，可以用作早期AS病變的分子成像的特異性靶標(biāo)[30]?？傊?NE在AS的發(fā)病進展中所起的作用可能比預(yù)想的要大，NE可能作為 AS新的防治靶點。

4.2 慢性肺疾病

4.2.1 COPD：蛋白酶-抗蛋白平衡失調(diào)是COPD的主要致病機制，導(dǎo)致中性粒細胞和巨噬細胞的大量肺浸潤，釋放過多的NE。E-cad是維持上皮細胞-細胞間緊密黏附的關(guān)鍵蛋白，NE介導(dǎo)血管E-cad的降解，破壞上皮細胞，導(dǎo)致肺上皮破壞和損傷；此外，NE能特異性降解彈性蛋白。彈性蛋白被NE降解時產(chǎn)生片段EL-NE，被評估為與慢性炎癥和肺氣腫相關(guān)的生物標(biāo)志物 NE除了降解組織蛋白外，它還能刺激黏液素的產(chǎn)生和分泌，從而導(dǎo)致COPD患者氣道阻塞。COPD患者的血清NE水平以及痰NE水平均升高[31,32]。遺傳因素 α1-PI缺乏增加了 COPD 發(fā)病的危險性，α1-PI 缺乏患者中，由于肺部的蛋白酶與其抑制劑失衡， 以NE為主的蛋白酶降解肺組織，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。HNE水平升高與肺氣腫的嚴重程度呈正相關(guān) 其機制是通過蛋白酶激活受體1(PAR1)切割。 另外，炎癥過程可以通過NE切割中性粒細胞PAR2受體來激活[33]。

研究表明，胎盤生長因子(PGF)和PGF觸發(fā)的下游信號分子介導(dǎo)NE誘導(dǎo)肺上皮細胞凋亡，同時NE可以增加PGF的表達，進一步加速肺細胞凋亡和肺氣腫的發(fā)生發(fā)展[34]。

4.2.2 CF：CF是由囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)基因突變產(chǎn)生的疾病，以早發(fā)性氣道黏液堵塞，自發(fā)性細菌感染，慢性炎癥和結(jié)構(gòu)性肺損傷為特征。NE是早期CF肺結(jié)構(gòu)損傷的預(yù)測因子,是肺病嚴重程度的關(guān)鍵風(fēng)險因素[36]。研究發(fā)現(xiàn)痰中性粒細胞的NE活性與CF患者的肺病嚴重程度相關(guān)[37]。即使在痰上清液中游離NE活性水平較低時，CF痰中性粒細胞表面的NE活性也一直在增加。進一步證明了表面NE活性與氣流受限和肺惡性膨脹的肺功能指標(biāo)相關(guān)。CF患兒的支氣管肺泡灌洗(BAL)體液NE活性升高與結(jié)構(gòu)異常(包括胸部CT發(fā)現(xiàn)的早期支氣管擴張)的發(fā)生和進展之間存在很強的聯(lián)系[37]。NE活性增加可通過CFTR的蛋白水解降解和ENaC的切割活化加劇堿性CF離子轉(zhuǎn)運缺陷。體表上皮和黏膜下腺體的CFTR功能異常導(dǎo)致氣道表面脫水和微酸性。這些缺陷導(dǎo)致黏液清除受損，抗菌肽減少細菌殺滅，從而為氣道黏液堵塞和宿主防御受損奠定了基礎(chǔ)，導(dǎo)致慢性中性粒細胞性炎癥、感染的惡性循環(huán)。

4.3 其他疾病 最近一些研究也報道了NE參與銀屑病、前粒細胞白血病、脊髓損傷、腦缺血、肥胖和胰島素抵抗等疾病的發(fā)生發(fā)展[38-41]。銀屑病和特應(yīng)性皮炎患者在外周血中性粒細胞中顯示過量的彈性蛋白酶，白細胞介素-36受體拮抗劑(IL-36Ra)與銀屑病炎癥相關(guān)，尤其是膿皰性銀屑病亞型中的功能喪失突變[38-42]。NE通過將IL-36Ra切割成其高度活躍的拮抗形式參與銀屑病炎癥[41]。研究發(fā)現(xiàn)，NE可以激活白血病細胞中磷酸肌苷-3激酶/Akt信號通路，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，說明NE可能參與前粒細胞白血病[40]。通過遺傳缺失或藥理學(xué)抑制特異性靶向NE對于瞬時局灶性缺血以及創(chuàng)傷性和缺血性脊髓損傷的嚙齒動物和兔模型具有急性神經(jīng)保護作用，提示NE參與脊髓損傷、腦缺血。NE和A1AT的失衡通過AMPK通路的調(diào)節(jié)影響能量消耗，促進肥胖相關(guān)炎癥、脂肪組織重構(gòu)、胰島素抵抗和肝臟脂肪變性的發(fā)生[38]。

5 NE相關(guān)疾病的治療思路

正如前所述，NE 與很多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能成為這些疾病的藥物防治靶點．根據(jù) NE的生物學(xué)功能與致病機理，筆者認為可以從以下幾個方面著手：(1)抑制NE的生成：組織蛋白酶C(CTSC，syn.Dipeptidly-peptidase I)是一種廣泛表達的NSPs 的激活劑，抑制CTSC 的活性能削弱 NSPs 的產(chǎn)生[43]。通過對內(nèi)源性活化劑CTSC 的抑制，使中性粒細胞活化減少，從而減少NE的產(chǎn)生?，F(xiàn)且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種能穿過細胞的無毒性CTSC 抑制劑，但這種抑制劑風(fēng)險大，對多種蛋白酶的均有抑制作用[43]。(2)抑制NE分泌：抑制劑rBmTI-6-D1 PPE-肺氣腫小鼠模型中抑制胰蛋白酶/激肽釋放酶活性，可以干擾NE分泌[43]。(3)清除或減少NE抑制劑的內(nèi)源性氧化劑和遠離外源性氧化劑：上述我們已知 α1-PI 和 α2-M等可被多種內(nèi)源性氧化劑和外源性氧化劑如煙草、化學(xué)試劑滅活，所以可通過清除或減少 NE 抑制劑的內(nèi)源性氧化劑和遠離外源性氧化劑來維持抑制劑的抑制作用，從而阻止疾病的發(fā)展。(4)設(shè)計針對于NE的不易被內(nèi)源性物質(zhì)氧化或降解的小分子特異性抑制劑。(5)聯(lián)合治療：對于COPD，除使用NE抑制劑外，還可以與其他療法一起應(yīng)用，例如DNA酶，黏液溶解劑和抗生素等[42]。慢性PA支氣管感染是CF和支氣管擴張持續(xù)的炎癥觸發(fā)的關(guān)鍵因素之一，所以可以聯(lián)合抗PA的基礎(chǔ)上使用NE抑制劑，從而阻止疾病的發(fā)展[43]。

6 問題與展望

NE 是中性粒細胞分泌的多功能絲氨酸蛋白酶，直接影響炎癥的發(fā)生發(fā)展。本文綜述了NE的生物學(xué)功能、參與相關(guān)疾病的機制及其作為疾病治療靶點的前景。對于NE相關(guān)疾病的治療，近年雖已研發(fā)出各種生物治療藥物，但療效還有待進一步的臨床觀察和評估。因此，研發(fā)出高效、特異性的NE抑制劑對于NE 相關(guān)疾病的防治具有非常重要的價值。本文綜述了NE及其與疾病之間關(guān)系，期望為NE相關(guān)疾病預(yù)防及治療提供新的視野。