miRNA-320及其靶基因內(nèi)皮素-1與多囊卵巢綜合征易感性及臨床特點(diǎn)的關(guān)系研究

牟靖 談宗國(guó) 吳萍

重慶三峽中心醫(yī)院婦科，萬(wàn)州 404100

多囊卵巢綜合征(PCOS)是女性最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病，影響5%～10%的育齡婦女[1]。研究表明，PCOS患者存在代謝紊亂，表現(xiàn)為肥胖、2型糖尿病和胰島素抵抗(IR)，約50%～70%的PCOS患者存在不同程度的IR[2]。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)，PCOS患者IR和高雄激素血癥之間存在關(guān)系[3]。miRNA-320具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可調(diào)節(jié)多種重要分子，尤其是內(nèi)皮素。研究表明，miRNA-320的靶基因內(nèi)皮素是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物活性肽，可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，其中內(nèi)皮素-1是最有效的生物分子，其合成和代謝失調(diào)與PCOS患者的IR密切相關(guān)[4]。PCOS發(fā)病機(jī)制中的遺傳因素，特別是與該綜合征病因有關(guān)的基因，以及環(huán)境因素在其表達(dá)中的作用，迄今尚未得到充分的研究[5]。本研究的目的是探討miRNA-320作為PCOS的一種非侵襲性生物標(biāo)志物的作用，并評(píng)價(jià)其與PCOS的IR及臨床形態(tài)學(xué)特征的可能關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年4月—2019年4月重慶三峽中心醫(yī)院婦科門(mén)診就診的75例為PCOS患者研究組，再根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)分為非IR-PCOS組(HOMA-IR≤2.11，n=40)和IR-PCOS組(HOMA-IR>2.11，n=35)，選擇同期門(mén)診就診的健康女性40名為對(duì)照組。PCOS組平均年齡為(31.95±7.42)歲，對(duì)照組平均年齡為(32.38±7.68)歲。PCOS的診斷依據(jù)2014英國(guó)皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)院PCOS的遠(yuǎn)期影響指南(NO.33)[6]。排除雄激素過(guò)多癥狀史(如非經(jīng)典先天性腎上腺皮質(zhì)增生、雄激素分泌腫瘤、庫(kù)欣綜合征、21-羥化酶缺乏癥或高催乳素血癥)、高血壓、肝、腎或甲狀腺疾病等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號(hào)：2017年科研第(023)號(hào)]，所有患者均同意參加研究并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室及超聲檢查 血液樣本取自受試者在月經(jīng)周期的早期卵泡期禁食過(guò)夜后的血液樣本。采用自動(dòng)生化分析儀(Roche Cobas 8000-c702，Roche Diagnostics，德國(guó))測(cè)定空腹血漿葡萄糖、總膽固醇、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、甘油三酯和低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)水平。通過(guò)陰道超聲評(píng)估卵巢體積和竇卵泡計(jì)數(shù)。

1.2.2 多毛癥評(píng)分 采用多毛癥Ferriman-Gallwey評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估多毛癥得分，1級(jí)為1分，2級(jí)為2分，3級(jí)為3分?？偡中∮?分為正常；總分6～9分提示毛發(fā)過(guò)多；總分大于9分為多毛。

1.2.3 ELISA 采用ELISA試劑盒測(cè)定血清內(nèi)皮素-1、空腹血清胰島素、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、總睪酮。HOMA-IR=空腹胰島素(mIU/L)×空腹血糖(mg/dl)/22.5，穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)=20×空腹胰島素(mIU/L)/[空腹血糖(mmol/L)-3.5][7]。

1.2.4 RT-PCR 采用miRNeasy mini試劑盒(Qiagen，德國(guó))從血清樣品中提取miRNA-320，采用Qubit 3 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)測(cè)定miRNA的濃度和純度，采用miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用Stratagene Mx3005P平臺(tái)(Agilent Technologies，USA)和Quanti Fast SYBR Green PCR Kit(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成U6 snRNA作為對(duì)照(表1)。總體積為20 μl反應(yīng)體系，其中10 μl Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix，2 μl正向引物，2 μl反向引物，4 μl無(wú)RNA酶水和2 μl cDNA。循環(huán)條件：95℃初始活化15 min，然后在94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。獲得表達(dá)值作為相對(duì)基因(ΔCT=靶基因CT-參考基因CT)。

2 結(jié)果

2.1 PCOS組與對(duì)照組的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征比較IR-PCOS組體重指數(shù)、空腹胰島素、HOMA-IR、雄烯二酮水平較對(duì)照組和非IR-PCOS組顯著升高(P均<0.05)，HOMA-β較對(duì)照組和非IR-PCOS組顯著降低(P均<0.05)。與對(duì)照組相比，IR-PCOS組和非IR-PCOS組卵巢體積、竇卵泡計(jì)數(shù)、甘油三酯、總膽固醇、LDL-C水平顯著升高(P均<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 miRNA-320和U6 snRNA基因PCR引物和擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 PCOS組與對(duì)照組的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征比較

注：PCOS：多囊卵巢綜合征；BMI：體重指數(shù)；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)；HOMA-β：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-β細(xì)胞功能指數(shù)；FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素；與對(duì)照組相比，aP<0.05；與非IR-PCOS組相比，bP<0.05；1 mmHg= 0.133 kPa

2.2 PCOS組與對(duì)照組血清miRNA-320及內(nèi)皮素-1水平比較 與對(duì)照組相比，PCOS組血清miRNA-320表達(dá)水平顯著降低(t=3.17，P=0.019)，血清內(nèi)皮素-1水平顯著升高(t=-5.483，P=0.002)，見(jiàn)圖1。與非IR-PCOS組相比，IR-PCOS組血清miRNA-320表達(dá)水平顯著降低(t=-2.864，P=0.029)，血清內(nèi)皮素-1水平顯著升高(t=2.513，P=0.048)，見(jiàn)圖2。

2.3 PCOS患者血清miRNA-320表達(dá)水平與臨床和生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示，PCOS組血清miRNA-320表達(dá)水平與多毛癥得分、卵巢體積、竇卵泡計(jì)數(shù)、甘油三酯、空腹胰島素、HOMA-IR、LH等呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與HOMA-β呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 PCOS患者血清miRNA-320水平影響因素的線性回歸分析及l(fā)ogistic回歸分析 線性回歸顯示，多毛癥得分和HOMA-IR是PCOS患者血清miRNA-320水平的主要影響因素，見(jiàn)表4。Logistic回歸結(jié)果顯示，miRNA-320表達(dá)水平是PCOS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表5。

2.5 血清miRNA-320、內(nèi)皮素-1水平預(yù)測(cè)PCOS的準(zhǔn)確性 采用受試者工作特征曲線評(píng)價(jià)血清miRNA-320表達(dá)水平對(duì)PCOS的診斷能力，曲線下面積為0.816(95%CI： 0.788～0.935,P<0.001)，敏感性為80%，特異性為97.5%，最佳截點(diǎn)為0.743，見(jiàn)圖3。血清內(nèi)皮素-1水平對(duì)PCOS的診斷能力，曲線下面積為0.822(95%CI： 0.804～0.959,P<0.001)，敏感性為91.7%，特異性為99.3%，最佳截點(diǎn)為5.66 ng/L，見(jiàn)圖4。

表3 PCOS患者血清miRNA-320表達(dá)水平與臨床和生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：PCOS：多囊卵巢綜合征；BMI：體重指數(shù)；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)；HOMA-β：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-β細(xì)胞功能指數(shù)；FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素

表4 PCOS患者血清miRNA-320水平影響因素的線性回歸分析

注：PCOS：多囊卵巢綜合征；BMI：體重指數(shù)；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)

表5 PCOS患者危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

注：PCOS：多囊卵巢綜合征；BMI：體重指數(shù)； LH：黃體生成素

3 討論

PCOS是一種以高雄激素血癥和IR為特征的復(fù)雜異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病。在非排卵期婦女的多囊卵巢中，調(diào)節(jié)竇卵泡發(fā)育的精確分子機(jī)制尚不清楚，但這些卵泡的生長(zhǎng)通常在成熟卵泡預(yù)期排卵前停止[8]。研究表明，miRNAs在PCOS女性的卵泡發(fā)育和類固醇生成中起關(guān)鍵作用[9]。由于血清miRNAs穩(wěn)定，對(duì)核酸酶活性具有抗性并且易于檢測(cè)，可能作為PCOS的非侵入性生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PCOS組存在IR、血脂異常以及PCOS表型特征顯著異常。PCOS組血清miRNA-320表達(dá)水平顯著降低，IR-PCOS組miRNA-320表達(dá)水平顯著低于非IR-PCOS組，IR-PCOS組空腹胰島素、HOMA-IR水平較對(duì)照組和非IR-PCOS組顯著升高，HOMA-β較對(duì)照組和非IR-PCOS組顯著降低。Massart等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病個(gè)體血清和糖尿病嚙齒類動(dòng)物心臟微血管細(xì)胞中miRNA的水平下降。Lv等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-320在高血糖患者中的表達(dá)降低，且miRNA-320可通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2負(fù)調(diào)控內(nèi)皮素-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和纖黏連蛋白的表達(dá)。劉凱魯?shù)萚12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-320在PCOS患者卵泡液中的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組。Li等[13]研究證實(shí)，與健康對(duì)照組相比，IR-PCOS組卵巢組織中miRNA-320表達(dá)下調(diào)，且miRNA-320可以通過(guò)胰島素受體底物-1調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號(hào)通路抑制IR。此外，Constantin等[14]研究表明，在卵巢發(fā)育過(guò)程中，miRNA-320在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，并與卵巢濾泡增殖和類固醇生成相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組血清內(nèi)皮素-1水平明顯高于對(duì)照組。Anggorowati等[15]也報(bào)道，與年齡匹配的對(duì)照組相比，PCOS患者內(nèi)皮素-1水平更高。與非IR-PCOS組相比，IR-PCOS組血清內(nèi)皮素-1水平顯著升高。內(nèi)皮素-1是反映血管內(nèi)皮功能的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)，而血管內(nèi)皮功能紊亂是心血管疾病、糖尿病及代謝綜合征的“中心環(huán)節(jié)”[15]。內(nèi)皮素-1受不同基因表達(dá)水平的調(diào)控，尤其是miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，miRNAs可以通過(guò)直接靶向mRNA并抑制其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，和(或)通過(guò)干擾表觀基因組，調(diào)節(jié)正常和疾病狀態(tài)下的基因表達(dá)[16]。此外，miRNA-320表達(dá)水平與PCOS獨(dú)立相關(guān)，其預(yù)測(cè)PCOS的特異性較高。

PCOS患者血清miRNA-320表達(dá)水平顯著降低，并負(fù)反饋調(diào)節(jié)內(nèi)皮素-1的水平。miRNA-320與PCOS患者多毛癥得分、卵巢體積、竇卵泡計(jì)數(shù)、甘油三酯、空腹胰島素、HOMA-IR、HOMA-β、LH等呈負(fù)相關(guān)，診斷PCOS的特異性高，可作為PCOS的無(wú)創(chuàng)診斷生物標(biāo)志物。