不同亞型Smads信號(hào)蛋白在慢性支氣管哮喘小鼠肺組織表達(dá)的意義

文莎，佘暉，游錦惠，劉雪君

支氣管哮喘是臨床上危害人類健康的重要慢性疾病之一，患病年齡段廣，從嬰幼兒至老年均可發(fā)生，與過敏、遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)[1]，病情反復(fù)發(fā)作，慢性持續(xù)性發(fā)展。Smad蛋白家族的名字來源于同源的秀麗隱桿線蟲Sma蛋白和黑腹果蠅Mad蛋白[2]。Smads家族蛋白是一類重要的胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳遞分子，可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、激活素(activins)、Nodal蛋白和生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，進(jìn)一步激活并調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)支氣管哮喘及氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。本研究旨在觀察慢性支氣管哮喘小鼠肺組織內(nèi)Smads各亞型信號(hào)蛋白的表達(dá)，探索不同亞型Smads蛋白及其傳導(dǎo)的信號(hào)通路在慢性支氣管哮喘小鼠慢性氣道炎癥及氣道重塑過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雌性6～8周齡BALB/C小鼠18只，體質(zhì)量(19±1)g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-2018]。(2)主要試劑：卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美國Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司)；小鼠Smad 1, 3, 4, 5, 7抗體(美國Abcam公司)；β-actin(美國Servicebio公司)。(3)主要儀器：壓縮型霧化器(PARIBOYN，德國百瑞公司)；光學(xué)顯微鏡(YS100型，尼康儀器有限公司)；離心機(jī)(D3024R，美國DragonLab公司)；組織切片掃描儀及分析軟件(Pannoramic MIDI,Quant center，3D HISTECH)；掃描儀(V300，美國Epson公司)；勻漿儀(KZ-II，美國Servicebio公司)；電泳儀(DYCZ-24DN，DYCZ-40D，北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1建立動(dòng)物模型

1.2.1.1建立急性哮喘(acute asthma，AA)組動(dòng)物模型 參照文獻(xiàn)[4]建立AA動(dòng)物模型。

1.2.1.2建立慢性哮喘(chronic asthma，CA)組動(dòng)物模型 參照文獻(xiàn)[5]及本實(shí)驗(yàn)組前期研究建立CA模型的方法，從實(shí)驗(yàn)第21天起，采用1% OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，每天霧化30 min，持續(xù)霧化5 d，連續(xù)霧化9周。末次霧化24 h后脫頸處死小鼠，觀察到肺臟表面顏色蒼白，質(zhì)硬，進(jìn)一步行肺組織病理切片蘇木素-伊紅(H-E)染色，光學(xué)顯微鏡下可見支氣管皺襞明顯增多，上皮細(xì)胞明顯增生紊亂，管腔狹窄，氣道及血管平滑肌細(xì)胞增生等慢性哮喘氣道重塑病理變化，動(dòng)物模型建立成功。

1.2.2分組 隨機(jī)均分為3組，即正常對(duì)照(normal control，NC)組、AA組和CA組。NC組不施加任何處理。

1.2.3肺組織病理切片H-E染色 觀察肺臟的大體病理變化，按照肺組織病理切片H-E染色標(biāo)準(zhǔn)步驟，經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色、封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道上皮損傷及氣道周圍病理改變。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達(dá) 按照免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化步驟，將石蠟切片分別經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、加Smad蛋白一抗、加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、加SP、加顯色劑、復(fù)染、脫水、封片等處理。光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況(深棕色為強(qiáng)陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性)，并使用Pannoramic組織切片掃描儀及Quant center軟件分析方法進(jìn)行小鼠肺組織內(nèi)Smad 1，3，4，5，7半定量的組織化學(xué)評(píng)分(histochemistry score，H-score)。

1.2.5Western-blot法檢測(cè)Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達(dá) 粉碎肺組織塊，按照Western-blot法規(guī)范化操作步驟，檢測(cè)Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1肺臟大體情況觀察及肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 NC組小鼠肺臟總體呈粉紅色，表面光滑、平整，無出血點(diǎn)及水腫，肺組織病理H-E染色后可見支氣管上皮細(xì)胞完整，黏膜無中斷，杯狀細(xì)胞低平，支氣管黏膜下及肺實(shí)質(zhì)血管旁少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。AA組小鼠肺臟總體呈暗紅色，表面充血水腫明顯，有較多出血點(diǎn)，顯微鏡下病理可見支氣管上皮細(xì)胞脫落，黏膜中斷，皺襞增加，杯狀細(xì)胞頂部空泡化明顯，肺泡間質(zhì)水腫，支氣管黏膜下及肺實(shí)質(zhì)血管旁可見以嗜酸性粒細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。CA組小鼠肺臟顏色、質(zhì)地不均一，紅白交雜，表面不平整，個(gè)別肺葉顏色蒼白、質(zhì)硬；進(jìn)一步行病理學(xué)檢測(cè)，顯微鏡下可見支氣管皺襞明顯增多，上皮細(xì)胞明顯增生紊亂，管腔狹窄，氣道及血管平滑肌細(xì)胞增生，肺泡破裂，黏膜下、毛細(xì)血管旁及肺泡內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(以嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主)，且毛細(xì)血管旁淋巴細(xì)胞彌漫包圍(圖1C)。

2.2免疫組織化學(xué)法觀察小鼠肺內(nèi)Smad 1，3，4，5，7的表達(dá) 各組小鼠肺組織內(nèi)可見藍(lán)染的細(xì)胞核背景色，檢測(cè)NC組Smad 1，3，4，5指標(biāo)，可見氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞核不染色，呈陰性反應(yīng)，細(xì)胞漿淡棕色，呈弱陽性反應(yīng)(圖2A，D，G，J)，但Smad 7細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均可見大面積深棕色顆粒，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖2M)；AA組Smad 1，5氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及氣道黏膜下、毛細(xì)血管旁及肺泡內(nèi)浸潤(rùn)的各類炎癥細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，細(xì)胞核、細(xì)胞漿均可見深棕色顆粒，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖2B，K)，但CA組Smad 1，5陽性反應(yīng)較AA組明顯減弱，呈中度陽性反應(yīng)(圖2C，L)；AA及CA組的Smad 3，4氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及浸潤(rùn)的各類炎癥細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞漿均可見棕色顆粒，呈中度以上陽性反應(yīng)(圖2E～F，H～I(xiàn))。CA組與AA組比較，可見更大面積深棕色顆粒，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖2F，I)。AA組肺組織內(nèi)Smad 7較NC組陽性反應(yīng)明顯減弱，呈弱陽性反應(yīng)(圖2N)；但CA組與AA組比較，陽性反應(yīng)增強(qiáng)，呈中度陽性反應(yīng)(圖2O)。進(jìn)一步行半定量的組織化學(xué)評(píng)分，AA組Smad 1，5表達(dá)較NC組增加明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但CA組較AA組減少明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AA組及CA組的Smad 3，4表達(dá)均較NC組升高(P<0.05);與AA組比較，CA組肺組織內(nèi)Smad 3，4表達(dá)升高(P<0.05)；AA組肺內(nèi)Smad 7表達(dá)較NC組降低(P<0.05)，但CA組較AA組表達(dá)升高(P<0.05)(表1)。

表1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肺內(nèi)Smad 1，3，4，5，7半定量的組織化學(xué)評(píng)分(H-sore)

Tab 1 Semi-quantitative histochemical scores of Smad 1, 3, 4, 5, 7 in the lungs of mice detected by immunohistochemisty (H-sore)

n=6. NC組：正常對(duì)照組；AA組：急性哮喘組；CA組：慢性哮喘組. 與NC組比較，△：P<0.05；與AA組比較，#：P<0.05.

2.3Western-blot法檢測(cè)Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達(dá) AA組小鼠肺組織內(nèi)Smad 1，5蛋白的相對(duì)表達(dá)量均較NC組增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但CA組較AA組明顯降低，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AA組及CA組的Smad 3，4的相對(duì)表達(dá)量均較NC組升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CA組比AA組表達(dá)量進(jìn)一步升高(P<0.05)。AA組Smad 7的蛋白表達(dá)量較NC組降低明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但CA組比AA組表達(dá)量進(jìn)一步升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

3 討 論

哮喘是一種與變應(yīng)源相關(guān)的、持續(xù)存在的慢性變應(yīng)性氣道炎癥性疾病[6]，參與炎癥反應(yīng)的各種生長(zhǎng)因子如TGF-β，BMP等通過募集細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳遞分子Smads蛋白，進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，轉(zhuǎn)運(yùn)入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致哮喘變應(yīng)性炎癥和氣道重塑[7]。Smad也被認(rèn)為參與了CDKN2B基因編碼p15的表達(dá)控制，CDKN1A基因編碼p21，c-myc，ID1和ATF3的表達(dá)[8]。

表2 Western-blot法檢測(cè)Smad 1，3，4，5，7的相對(duì)表達(dá)量

n=6. NC組：正常對(duì)照組；AA組：急性哮喘組；CA組：慢性哮喘組. 與NC組比較，△:P<0.05；與AA組比較，#:P<0.05.

Smads蛋白成員主要包括Smad 1-8，可以分為3個(gè)亞家族：受體激活的Smad(Smad proteins regulated by the receptor, R-Smads)、協(xié)同作用的Smad(co-mediating Smad，Co-Smad)、起抑制作用的Smad(inhibitory Smad，I-Smad)[9]。R-Smads主要包括Smad 1，2，3，5，8，其負(fù)責(zé)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，在結(jié)構(gòu)上，均由僅連接結(jié)構(gòu)不同的MH結(jié)構(gòu)域(與果蠅蛋白Mad同源)組成，N-端區(qū)域(即MH1)結(jié)合DNA，C-端區(qū)域(即MH2)負(fù)責(zé)核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)及調(diào)控。Co-Smad目前僅發(fā)現(xiàn)Smad 4蛋白，其可以與磷酸化R-SMAD蛋白形成R-SMAD-Co-SMAD復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核，通過MH1結(jié)合TGF-β1、activins和BMP基因的CAGAC序列(SMAD-binding domain,SBD),對(duì)信號(hào)做出反應(yīng)，以激活轉(zhuǎn)錄[10]。信號(hào)傳遞過程完成后，激活的R-Smad蛋白在特異磷酸酶作用下去磷酸化，同時(shí)，Smad 7誘導(dǎo)參與的已活化蛋白泛素化蛋白酶解和溶酶體降解。

目前，TGF-β1/Smads信號(hào)通路與支氣管哮喘、氣道重塑之間的關(guān)系逐漸得到大家的認(rèn)識(shí)。TGF-β1可與細(xì)胞膜表面的TGF-β受體(TGF-β receptors，TGFR)結(jié)合，募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的R-Smads即Smad 2，3，使其磷酸化而激活，進(jìn)一步與Co-Smad協(xié)同作用進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，轉(zhuǎn)運(yùn)入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致哮喘變應(yīng)性炎癥[7]。本研究中，筆者觀察到AA組肺組織內(nèi)Smad 3，4表達(dá)明顯升高，考慮TGF-β1/Smads信號(hào)通路在急性哮喘小鼠肺組織內(nèi)活化激活。

同時(shí)，TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的趨化，刺激其增殖，增加成纖維細(xì)胞、纖連蛋白、蛋白聚糖、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成以及抑制膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的基因表達(dá)，導(dǎo)致氣道重塑[11]。另外，TGF-β1還可促進(jìn)氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)細(xì)胞增殖[12]。TGF-β1通過結(jié)合跨膜蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶受體，磷酸化激活下游Smad 2，3信號(hào)蛋白，與Co-Smad協(xié)同作用進(jìn)行核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。Smad 2，3可以直接與DNA相結(jié)合而發(fā)揮作用，也可以同其他因子如P300/CBP、MSC1等協(xié)同激活DNA上其他因子轉(zhuǎn)錄，如激活MyoD、AR等的表達(dá)，而ski、HDACs等對(duì)Smad 2，3信號(hào)系統(tǒng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用[8]。本研究中，筆者也觀察到CA組肺組織內(nèi)Smad 3，4表達(dá)較AA組明顯升高，考慮慢性哮喘肺組織內(nèi)TGF-β1/Smads信號(hào)通路極有可能在急性哮喘基礎(chǔ)上進(jìn)一步活化。

BMPs在調(diào)控胚胎肺及支氣管發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其可能在維持呼吸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[13]。Smad 1，5，8參與BMPs信號(hào)傳遞，可被ActR-I，BMPR-IA或BMPR-IB磷酸化而激活。Rosendahl等通過構(gòu)建過敏性氣道炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯苛薆MP蛋白水平的變化及Smad蛋白的激活[14]，發(fā)現(xiàn)與正常上皮細(xì)胞對(duì)比，炎癥化的支氣管上皮細(xì)胞和其他肺泡細(xì)胞表達(dá)磷酸化Smad 1(pSmad 1/5)，提示BMP/Smad信號(hào)通路的激活。在本研究中，筆者也觀察到AA組肺組織內(nèi)Smad 1，5表達(dá)升高，考慮為急性哮喘時(shí)BMP/Smad信號(hào)通路被激活。但在慢性持續(xù)性過敏原刺激下的CA組卻觀察到Smad 1，5表達(dá)降低，其具體的機(jī)制及作用有待進(jìn)一步研究。

Smad 7屬于I-Smad，結(jié)構(gòu)與R-Smads完全不同，I-Smad只有C-端結(jié)構(gòu)域，而沒有N-端結(jié)構(gòu)域[9]。Smad 7可以抑制Smad 1，2，3，5，8信號(hào)通路，也可以通過誘導(dǎo)TGFR-Ⅱ受體降解，抑制R-Smad磷酸化，影響R-Smad-Co-Smad復(fù)合物的形成。I-Smad蛋白與R-Smad相互競(jìng)爭(zhēng)，阻止其與受體或Smad 4結(jié)合，從而阻斷TGF-β1、BMP信號(hào)傳遞[15]。此外，Smad 7還參與SMURF2泛素連接酶向TGF-β1受體的募集，導(dǎo)致TGFR-I-TGFR-II復(fù)合物、Smad 7和Smad 2蛋白酶解和溶酶體降解[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，AA組小鼠肺組織內(nèi)Smad 7蛋白表達(dá)明顯降低，有助于TGF-β1信號(hào)通路的活化；而CA組肺組織內(nèi)Smad 7蛋白高表達(dá)，是否與機(jī)體自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)反應(yīng)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。