桑枝活性成分的提取及其抑菌和抗氧化作用

馮馨慧　劉志明　王海英

摘要：以桑枝作為原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性。氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果表明，桑枝乙醇提取物的揮發(fā)性組分，主要由酯類（47.76%）、烷烴類（20.27%）、芳香烴類（15.84%）等化合物組成，GC含量最高的化合物是鄰苯二甲酸二丁酯（41.20%），GC含量較高的化合物為十一烷（20.27%）。桑枝乙醇提取物的抑菌活性研究結(jié)果表明，桑枝乙醇提取物對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）具有較好的抑菌活性，抑菌圈直徑為（11.77±0.54） mm。桑枝乙醇提取物的抗氧化活性研究結(jié)果表明，桑枝乙醇提取物50% DPPH自由基清除率質(zhì)量濃度（IC50）為1.570 mg/mL，維生素C IC50為0.001 mg/mL。桑枝乙醇提取物50%羥基自由基清除率質(zhì)量濃度（IC50）為68.437 mg/mL，維生素C IC50為7.082 mg/mL。桑枝乙醇提取物對(duì)DPPH自由基具有較好的清除作用。

關(guān)鍵詞：桑;氣相色譜-質(zhì)譜;乙醇提取物;抑菌活性;抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）07-0217-04

桑（Morus alba）為桑科（Moraceae）桑屬喬木或灌木，東北至西南各省區(qū)等均有栽培[1]。桑葉、桑椹為國(guó)家衛(wèi)生部藥食同源名錄中的品種，桑白皮、桑枝為可用于保健食品名錄中的品種[2-5]。桑枝中起主要藥理活性作用的成分為桑枝多糖、黃酮類、生物堿類化合物，桑枝黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化作用[6-10]。桑枝在食用菌、木醋液等行業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用方興未艾[11-12]。桑種植園每年撫育間伐的桑枝資源豐富，高附加值桑枝的開(kāi)發(fā)利用是桑枝加工利用亟待解決的問(wèn)題之一。本研究以桑枝作為原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，簡(jiǎn)稱GC-MS）分析桑枝乙醇提取物的揮發(fā)性成分，以期為桑枝的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)用桑枝采自黑龍江省齊齊哈爾市甘南林場(chǎng)的桑產(chǎn)業(yè)科技示范園，來(lái)源植物為?？粕偕５膿嵊g伐剩余物[13-15]。

供試菌種主要有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans），由東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)主要試劑有二苯基苦基肼自由基（DPPH·）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、無(wú)水乙醇、維生素C，均為分析純。瓊脂，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

試驗(yàn)主要儀器有索氏提取裝置（自制）、RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑枝乙醇提取物的制備

采用索氏提取裝置，溶劑為無(wú)水乙醇。桑枝粉碎過(guò)篩，取10 g桑枝粉末（≤0.425 mm），用濾紙包好并用細(xì)線扎緊后放入濾筒內(nèi)，圓底燒瓶中加入100 mL無(wú)水乙醇，放入水浴鍋內(nèi)，連接好索氏提取裝置各部分，接通冷凝水，索氏提取5 h，制得桑枝乙醇提取液。溫度設(shè)為50 ℃，大氣壓強(qiáng)為0.1 MPa，轉(zhuǎn)速為35 r/min，用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)法除去無(wú)水乙醇，制得桑枝乙醇提取物。

1.2.2 桑枝乙醇提取物的GC-MS分析

將桑枝乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對(duì)試樣進(jìn)行分析。色譜分析條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;FID檢測(cè)器;初始溫度為40 ℃（保持2 min），以10 ℃/min的升溫速率升到280 ℃（保持2 min）;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;進(jìn)樣量為1.0 μL;不分流，氦氣載氣，流速為1 mL/min。質(zhì)譜分析條件：EI電離源，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍30～500 u。

1.2.3 桑枝乙醇提取物的抑菌活性

采用濾紙片法測(cè)定桑枝乙醇提取物的抑菌活性[16-18]。分別取活化培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌（S. aureus）、大腸桿菌（E. coli）、白色念珠菌（C. albicans）置于液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，再配制成濃度為106～107 CFU/mL 的菌懸液，用移液槍吸取已活化好的菌懸液20 μL，將其均勻涂抹在冷卻后的瓊脂平板表面，制成含菌平板。取浸泡過(guò)10 mg/mL桑枝提取物的干燥6 mm圓形濾紙片，貼在上述制好的含菌平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）貼上3片浸過(guò)同一種質(zhì)量濃度溶液的濾紙片（濾紙片盡量間隔相同），以不含藥濾紙片作為空白對(duì)照。把處理過(guò)的含菌平板置于恒溫箱中（溫度控制在37 ℃），培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4 桑枝乙醇提取物的抗氧化活性

1.2.4.1 樣品溶液的配制

稱取1 g桑枝乙醇提取物，加入100 mL無(wú)水乙醇充分溶解，得到10 mg/mL 的樣品母液，用移液管準(zhǔn)確移取體積為0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL的母液，定容，至10 mL容量瓶中，得到0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mg/mL的樣品溶液。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

精確稱取0.02 g DPPH樣品，加入無(wú)水乙醇定容至500 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液。向DPPH溶液中加入自由基清除劑，孤對(duì)電子被配對(duì)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以通過(guò)吸光度的變化進(jìn)行定量分析[19-22]。稱取1 g維生素C，加入1 000 mL 水定容為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取2、4、6、8 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，作為標(biāo)準(zhǔn)液待用。分別取2 mL不同濃度的樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，于517 nm處測(cè)吸光度（D1），用無(wú)水乙醇替代樣品溶液測(cè)定吸光度（D0），用無(wú)水乙醇替代DPPH溶液測(cè)定吸光度（D2）。平行操作3次，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用以下公式計(jì)算：

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