具鐵載體活性病原細(xì)菌的篩選及鐵攝取干預(yù)對(duì)其生長影響

何翔 張慶 李楚 番華彩 李銘剛 徐勝濤 陳齊斌 楊明英 楊佩文

摘要 絕大多數(shù)病原菌可分泌鐵載體，利用螯合性鐵載體及病原菌對(duì)Fe3+的競爭可實(shí)現(xiàn)病害的有效防控。從植物病原菌中篩選高產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢(shì)菌株，并基于EDTA對(duì)鐵離子的強(qiáng)螯合性，可為病害防控提供新的方法。本研究采用CAS檢測(cè)法和光吸收法對(duì)42株供試植物病原菌株進(jìn)行定性、定量篩選及鐵載體類型的初步鑒定，依據(jù)菌株形態(tài)電鏡觀察和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分類鑒定，并基于微量稀釋法測(cè)定EDTA對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的最低抑菌濃度。經(jīng)定性、定量篩選，確定7株供試細(xì)菌為高產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢(shì)菌株，分泌鐵載體類型為兒茶酚型和異羥肟酸型;根據(jù)形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定，菌株TZT-057和TZT-058與惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的一致性最高，TZT-059、TZT-063和TZT-064與肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的一致性最高，TZT-062、TZT-073分別與魯氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter lwoffii、迪克氏菌Dickeya zeae的一致性最高。根據(jù)微量稀釋法抑菌活性測(cè)定結(jié)果可知，EDTA對(duì)菌株TZT-058、TZT-073的抑菌效果較好，抑菌率分別為85.16%、80.08%，表明強(qiáng)螯合劑EDTA能有效干預(yù)病原細(xì)菌對(duì)鐵元素的攝取過程，進(jìn)而影響其生長繁殖。

關(guān)鍵詞 植物病原菌; 鐵載體; 篩選鑒定; 乙二胺四乙酸

中圖分類號(hào)： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019131

Abstract

Most pathogenic microorganisms have the function of secreting siderophore， and the competition between sorghum siderophore and pathogens against Fe3+ can be used to effectively prevent and control diseases. The dominant strains producing high-yield siderophore were screened from plant pathogens， and based on the strong chelating property of EDTA to iron， it could provide a new method for the control of plant diseases. In this study， we qualitatively and quantitatively screen the pathogenic strains of different host plants and preliminarily identified the siderophore types by using the CAS method and light absorption method. Meanwhile， the biological identification of the dominant strains was performed by using the electron microscopy and 16S rDNA sequence. The minimum inhibitory concentration of EDTA against dominant strains was determined based on the microdilution method. The results showed that there were 7 strains that were identified as high siderophore-producing dominant strains from the test bacteria through qualitative and quantitative screening， and the types of secretory siderophore were catecholates and hydroxamates. Base on the morphological characteristics and molecular identification， the strains TZT-057 and TZT-058 shared similarity with Pseudomonas putida; the strains TZT-059， TZT-063 and TZT-064 were very similar to Klebsiella pneumoniae; the strain TZT-062 was analogous to Acinetobacter lwoffii， and strain TZT-073 resembled Dickeya zeae. According to the microbial dilution assay， EDTA had better antibacterial activity against strains TZT-058 and TZT-073， and the inhibition rates were 85.16% and 80.08%， respectively. The results suggested that EDTA could effectively affect the uptake process of iron by pathogenic bacteria， and affect its growth and reproduction.

Key words

plant pathogen; siderophore; screening and identification; EDTA

鐵在地殼和土壤中的含量十分豐富，同時(shí)鐵作為地球上幾乎所有生物體必需的營養(yǎng)元素之一，在各項(xiàng)機(jī)能代謝活動(dòng)和酶促反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用;但在自然界中性或堿性有氧條件下，鐵主要以難溶的Fe3+化合物形式存在，可溶性Fe2+含量較匱乏，生物可利用率極低[13]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植株缺鐵現(xiàn)象較為普遍，給農(nóng)林作物生物量的生產(chǎn)和植株系統(tǒng)抗性造成極大的影響。為適應(yīng)高氧低鐵的脅迫環(huán)境，許多微生物自身誘導(dǎo)合成分泌一類與Fe3+具高親和性且能與其特異性螯合的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物—鐵載體，用以螯合宿主體內(nèi)或周圍環(huán)境中大量難溶性的鐵，并通過氧化還原反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為可溶性的鐵，為生物體提供充足的鐵元素，同時(shí)也能有效減少環(huán)境中病原菌可利用鐵的含量而降低其致病力，增強(qiáng)植株抗性[45]。

關(guān)于鐵載體的研究早在1950年前后就有報(bào)道，根據(jù)鐵載體官能團(tuán)和中心結(jié)構(gòu)的多樣性，可分為兒茶酚型（catecholates）、異羥肟酸型（hydroxamates）和羧酸鹽型（carboxylates）[67]。相較于其他微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，關(guān)于植物病原菌分泌鐵載體的研究還較少[89]。目前，有關(guān)植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）、植物內(nèi)生菌（endophyte）等微生物分泌鐵載體的研究較多，且主要為鐵載體產(chǎn)生菌初步分離篩選的研究[1012]。而有關(guān)植物病原菌分泌鐵載體的研究，目前國內(nèi)外的報(bào)道還較少。乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）是一種重要的強(qiáng)螯合劑，能與環(huán)境中的堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定且水溶性較好的螯合物。微生物純培養(yǎng)環(huán)境中，EDTA的外源添加能介導(dǎo)微生物對(duì)必需金屬元素的吸收利用，進(jìn)而影響其生長繁殖。因此對(duì)鐵載體產(chǎn)生菌進(jìn)行相關(guān)研究，充分利用具分泌鐵載體功能的植物病原菌菌種資源，并測(cè)定抑菌藥物對(duì)其的最低抑菌濃度（MIC），探索分泌型鐵載體在植物病害防治中的作用機(jī)制具有重要的研究前景和補(bǔ)充意義。

為挖掘更多的微生物資源，本研究采用CAS檢測(cè)法和光吸收法，從不同宿主植物病原細(xì)菌中篩選高產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢(shì)菌株，并基于微量稀釋法測(cè)定EDTA對(duì)其最低抑菌濃度（MIC），以期為具分泌鐵載體能力的植物病原菌菌種資源的研究、開發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

42株供試植物病原細(xì)菌均為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所保藏菌種（表1）。

1.2 供試溶液及培養(yǎng)基的制備

CAS檢測(cè)液：稱取0.060 5 g鉻天青S（chromeazurol S， CAS）溶于50 mL去離子水中，并加入10 mL FeCl3溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O+10 mmol/L HCl）攪拌混勻，標(biāo)記為“A液”;再稱取0.072 9 g十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide， HDTMA）溶于40 mL去離子水，標(biāo)記為“B液”;最后將A液緩慢倒入B液中，并攪拌均勻。

TTC顯色劑的制備：稱取1.0 g氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride， TTC）溶于10 mL去離子水中，用0.22 μm無菌濾膜過濾后轉(zhuǎn)入無菌EP管中保存?zhèn)溆?，得?.1 g/mL 的無菌TTC溶液。

EDTA藥液的制備：稱取40 mg EDTA溶于2 mL去離子水中，并用0.22 μm無菌濾膜過濾后轉(zhuǎn)入無菌EP管中保存?zhèn)溆?，得?0 mg/mL的無菌測(cè)試母液。

醋酸鹽緩沖液的配制：將847 mL 0.1 μmol/L的H3COOH溶液加入到容量瓶內(nèi)，并加0.1 μmol/L的CH3COONa溶液，定容至1 000 mL，蓋緊瓶塞振蕩混勻。

供試菌株菌懸液的制備：無菌條件下，在供試菌株斜面內(nèi)加入2 mL無菌去離子水并刮取菌苔，轉(zhuǎn)入無菌EP管中保存?zhèn)溆?吸取一定量的菌液于無菌試管內(nèi)，加入無菌去離子水稀釋，采用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定待測(cè)液的OD625，使稀釋后的待測(cè)液OD625介于0.098 0～0.220 9之間。

無鐵查氏液體培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L、硝酸鈉2.0 g/L、三水合磷酸鉀1.0 g/L、氯化鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、8-羥基喹啉0.75 g/L、去離子水1.0 L。

LB去鐵液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、8-羥基喹啉0.75 g/L、去離子水1.0 L，pH自然（固體斜面培養(yǎng)基添加瓊脂，15～20 g/L）。

TTC-LB液體培養(yǎng)基：40 mL常規(guī)無菌LB液體培養(yǎng)基中加入2.0 mL 0.1g/mL TTC溶液，混勻后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分泌型鐵載體產(chǎn)生菌定性初篩和定量復(fù)篩

從LB固體斜面培養(yǎng)基上活化的細(xì)菌中挑取單菌落接種至LB去鐵液體培養(yǎng)基內(nèi)，每株菌株3個(gè)重復(fù)，置于28℃微生物培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)液體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)渾濁時(shí)，吸取50 μL發(fā)酵培養(yǎng)液于96孔板內(nèi)，加入等體積CAS檢測(cè)液充分混勻，以飽和的EDTA溶液（與CAS檢測(cè)液反應(yīng)呈紅色）為陽性對(duì)照，未接種的培養(yǎng)液與CAS檢測(cè)液等體積混合作為陰性對(duì)照，觀察并記錄顏色變?yōu)榧t色、橙紅色的培養(yǎng)液，并將相應(yīng)菌株作為復(fù)篩菌株。

初篩入選的菌株用無鐵查氏液體培養(yǎng)基于28℃ 150 r/min的恒溫?fù)u床（型號(hào)：HS-200B）上培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后吸取2～5 mL培養(yǎng)液用0.22 μm無菌濾膜過濾后加入等體積的CAS檢測(cè)液，靜置1 h后用全波長酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiska GO）測(cè)定其OD630（記作“As”），用相同方法測(cè)定未接菌的液體培養(yǎng)基的OD630作為參比值（記作“Ar”）。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位（siderophore unit， SU）表示，SU=[（Ar-As）/Ar]×100%，測(cè)定重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行比較分析。

1.4 復(fù)篩菌株鐵載體的化學(xué)結(jié)構(gòu)初步鑒定

1.4.1 異羥肟酸型鐵載體

采用氯化鐵檢測(cè)法（FeCl3 test）鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 2% FeCl3溶液，出現(xiàn)紅色或紫色表明測(cè)試樣品中含有鐵載體物質(zhì)。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，在420～450 nm 之間出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為異羥肟酸型鐵載體。

1.4.2 兒茶酚型鐵載體

采用氯化鐵檢測(cè)法鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 2% FeCl3溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，如果在495 nm附近出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為兒茶酚型鐵載體。

1.4.3 羧酸型鐵載體

采用分光光度法鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 0.25 μmol/L CuSO4溶液和2 mL pH4.0的醋酸鹽緩沖液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，在190～280 nm之間出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為羧酸型鐵載體。

1.5 菌株16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序、序列分析及菌落形態(tài)電鏡觀察

分泌型鐵載體產(chǎn)生菌菌株的16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序參照王麗麗等[13]的方法。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）后與 GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的基因序列進(jìn)行比較分析，選用同源性較高的模式菌株序列作為參比對(duì)象，用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算供試菌株與參比菌株序列的相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)排除堿基缺失位點(diǎn)，采用鄰接法（neighbor-joining analysis）用MEGA 7構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，Bootstrap值設(shè)定為1 000，其余均為默認(rèn)值。分泌型鐵載體產(chǎn)生菌菌落形態(tài)掃描電鏡觀察參照侯旭等[14]的方法。

1.6 EDTA對(duì)分泌型鐵載體產(chǎn)生菌生長的影響

1.6.1 定性檢測(cè)

采用微量稀釋法進(jìn)行定性檢測(cè)，每菌株各3個(gè)重復(fù)。分別在96孔板內(nèi)添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基;A1～A12設(shè)置為陰性對(duì)照，只添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基，不添加菌懸液，B1～B12設(shè)置為生長對(duì)照，添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液;在C1、D1、E1孔內(nèi)加入100 μL 20 mg/mL的無菌EDTA藥液，并采用倍半稀釋的方法對(duì)EDTA藥液進(jìn)行稀釋，直至最后一孔，此時(shí)該三列孔內(nèi)EDTA的濃度從左往右依次為：10、5、2.5……0.156 25 mg/mL，而后每孔再加入100 μL稀釋好的菌懸液，此時(shí)每孔的藥液濃度從左到右依次為：5、2.5、1.25……0.078 1 mg/mL;將96孔板放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，定期觀察并記錄孔板的顏色變化。

1.6.2 定量測(cè)定

采用微量稀釋法進(jìn)行定量測(cè)定，每菌株各3重復(fù)。分別在96孔板內(nèi)添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基;A1～A12設(shè)置為陰性對(duì)照，只添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基，不添加菌懸液，B1～B12設(shè)置為生長對(duì)照，添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液;在C1、D1、E1孔內(nèi)加入100 μL 20 mg/mL的無菌EDTA藥液，并對(duì)EDTA藥物進(jìn)行倍半稀釋直至最后一孔，此時(shí)該三列孔內(nèi)濃度從左往右依次為：10、5、2.5……0.156 25 mg/mL，而后再加入100 μL稀釋好的菌懸液，此時(shí)每孔的藥液濃度從左到右依次為：5、2.5、1.25……0.078 1 mg/mL;將96孔板放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，測(cè)定每塊板的OD630，并根據(jù)公式計(jì)算EDTA對(duì)供試菌株的抑菌率。測(cè)定過程中，藥品組吸光度值與生長對(duì)照組區(qū)別不大的孔樣可忽略不計(jì)，僅明顯低于對(duì)照組的樣品的吸光度值才進(jìn)行抑制率計(jì)算。計(jì)算公式如下：

抑制率=（生長對(duì)照組吸光度—藥品組吸光度）/生長對(duì)照組吸光度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌型鐵載體產(chǎn)生菌的定性初篩和定量復(fù)篩

根據(jù)CAS檢測(cè)液特有的顯色反應(yīng)，從42株供試細(xì)菌中初步篩選出18株有顏色變化的細(xì)菌，其中有13株為紅色或橙紅色，5株為紫色（表2），因而可將這18株細(xì)菌作為復(fù)篩目標(biāo)菌株。根據(jù)18株復(fù)篩菌株培養(yǎng)液和CAS檢測(cè)液混合后顏色變化的深淺可知，菌株TZT-057、TZT-058、TZT-059、TZT-062、TZT-063、TZT-064和TZT-073與CAS檢測(cè)液顯色反應(yīng)過程較迅速，反應(yīng)后呈鮮紅色，表明分泌鐵載體的活性最強(qiáng)。因而這7株復(fù)篩菌株作為后續(xù)研究對(duì)象。

如表3所示，復(fù)篩選出的7株優(yōu)勢(shì)菌株其As/Ar均小于0.5，且鐵載體活性單位（SU）均大于50.0%，表明所選的7株優(yōu)勢(shì)菌株均為高產(chǎn)鐵載體菌株。

2.2 復(fù)篩菌株鐵載體類型的鑒定

如表4所示，菌株TZT-059、TZT-062、TZT-063、TZT-064能合成分泌兒茶酚型鐵載體和異羥肟酸型鐵載體，菌株TZT-057、TZT-058和TZT-073只能合成分泌兒茶酚型鐵載體。

2.3 分泌型鐵載體產(chǎn)生菌的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 菌株16S rDNA序列分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建

在初步形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，利用16S rDNA序列PCR擴(kuò)增通用引物進(jìn)一步對(duì)篩選到的7株高產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行目標(biāo)序列的PCR擴(kuò)增、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，并與同源性較高的典型標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行同源對(duì)比，明確菌株的生物學(xué)分類地位。

研究結(jié)果表明：菌株TZT-059（登錄號(hào)：MH922846）、TZT-063（登錄號(hào)：MH930397）和TZT-064（登錄號(hào)：MH930398）的16S rDNA基因片段分別為1 439、1 441、1 445 bp。其中，菌株TZT-059和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號(hào)：MF767577）的相似性達(dá)99.73%，TZT-063和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號(hào)：KJ803926）的相似性達(dá)99.86%，TZT-064和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號(hào)：KU937377）的相似性達(dá)99.85%，菌株間均具有極高同源性。

如圖1所示，菌株TZT-057（登錄號(hào)：MH922842）、TZT-058（登錄號(hào)：MH922845）、TZT-062（登錄號(hào)：MH930396）和TZT-073（登錄號(hào)：MH820116）的16S rDNA基因片段分別為1 397、1 398、1 401 bp和1 351 bp。采用BLAST搜索與GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄序列比對(duì)，選擇有詳細(xì)信息的18株標(biāo)準(zhǔn)菌株（type culture strain）作為參比菌株，進(jìn)行Clustal W多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。菌株TZT-057、TZT-058和P.putida（登錄號(hào)：NR114479）間具有極高同源性，初步鑒定為普羅特斯門，γ普羅特斯綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬，惡臭假單胞P.putida。菌株TZT-062和A.lwoffii（登錄號(hào)：NR026209）的相似性達(dá)99.76%，菌株間具有極高同源性，初步鑒定為變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，莫拉氏菌科，不動(dòng)桿菌屬，魯氏不動(dòng)桿菌A.lwoffii。菌株TZT-073和D.zeae（登錄號(hào)：NR041923）的相似性達(dá)99.81%，菌株間具有極高同源性，初步鑒定為變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，果膠桿菌科，歐文氏菌屬，迪克氏菌Dickeya zeae。

2.3.2 分泌型鐵載體產(chǎn)生菌菌落形態(tài)電鏡觀察

4株產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)掃描電鏡放大21 000倍后其形態(tài)結(jié)果如圖2所示。菌株TZT-057為橢圓狀單球菌，直徑0.63～0.75 μm，菌株表面附著一層細(xì)且短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀單生鞭毛;菌株TZT-058為長桿狀菌，長2.26 μm，寬0.71 μm，菌株表面附著少量細(xì)短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀單生鞭毛;菌株TZT-062呈圓球狀，為雙球菌，直徑0.86～0.88 μm，菌株表面無菌毛，頂端著生略短的單生鞭毛;菌株TZT-073為長桿狀菌，長2.14 μm，寬0.84 μm，菌株表面附著一層細(xì)短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀鞭毛。

2.4 EDTA對(duì)分泌型鐵載體產(chǎn)生菌生長的影響

根據(jù)微量稀釋法對(duì)7株優(yōu)勢(shì)菌株定性、定量抑菌活性測(cè)定結(jié)果及判定標(biāo)準(zhǔn)可知，EDTA對(duì)菌株TZT-058（Accession no.MH922845）、TZT-073（Accession no.MH820116）有較好的抑菌活性。菌株TZT-058生長對(duì)照組吸光度值為0.505 1，藥品組平均吸光度值為0.074 9，根據(jù)計(jì)算公式，EDTA對(duì)菌株TZT-058的抑菌率為85.16%，對(duì)應(yīng)的最低抑菌濃度為0.019 5 mg/mL;菌株TZT-073生長對(duì)照組吸光度值為0.296 4，藥品組平均吸光度值為0.059 1，根據(jù)計(jì)算公式，EDTA對(duì)菌株TZT-058的抑菌率為80.08%，對(duì)應(yīng)的最低抑菌濃度為0.312 5 mg/mL。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中存在強(qiáng)螯合劑EDTA時(shí)，其能更有效地干預(yù)病原細(xì)菌對(duì)鐵元素的攝取過程，影響自身的各項(xiàng)機(jī)能代謝活動(dòng)，抑制生長繁殖。

3 討論

EDTA能與鐵離子特異性螯合，且可溶性的鐵離子又在微生物各項(xiàng)機(jī)能代謝過程中發(fā)揮著重要作用。前期研究表明，當(dāng)植物病原菌培養(yǎng)環(huán)境中存在EDTA溶液時(shí)，EDTA能利用其較強(qiáng)的螯合能力更有效的競爭環(huán)境中的鐵離子，使病原物處于缺鐵脅迫條件，延緩鐵蛋白復(fù)合物的形成，直接影響病原物對(duì)鐵離子的吸收利用機(jī)制，進(jìn)而抑制其生長繁殖，起到防控病害的作用。本研究首次以植物病原細(xì)菌為篩選靶標(biāo)，采用CAS檢測(cè)法和光吸收法對(duì)42株不同宿主植物病原細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)鐵載體活性篩選，并確定7株高產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢(shì)菌株。經(jīng)鐵載體化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步鑒定，所產(chǎn)鐵載體類型為異羥肟酸型和兒茶酚型。有研究指出，細(xì)菌主要合成分泌異羥肟酸型和兒茶酚型鐵載體[15]，本研究結(jié)果與之相吻合。此外，比較分析本研究兩種類型鐵載體的鐵螯合能力，兒茶酚型>異羥肟酸型，與Wang等[16]的研究結(jié)果一致;此外，本研究篩選到的7株植物病原菌均能分泌兒茶酚型鐵載體，且SU均大于50%。本研究還開展了抑菌藥物EDTA對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的抑菌活性研究，結(jié)果表明EDTA對(duì)P.putida和D.zeae均具有較好的抑菌活性。

經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，本研究篩選到7株產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢(shì)菌株均為革蘭氏陰性菌，K.pneumoniae 3株、P.putida 2株、A.lwoffii和D.zeae各1株。目前尚未有關(guān)于A.lwoffii和D.zeae分泌鐵載體的研究報(bào)道，因而本研究篩選出的這兩株菌株可作為后續(xù)鐵載體相關(guān)研究工作的優(yōu)選材料。目前，已有大量關(guān)于克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和歐文氏菌屬微生物分泌鐵載體的研究報(bào)道。肺炎克雷伯氏菌為常見的高產(chǎn)鐵載體微生物，目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其研究較為全面[1012]。假單孢菌屬也是常見的高產(chǎn)鐵載體優(yōu)勢(shì)屬，研究者們先后從不同寄主植株或根際土壤中發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌[17]、熒光假單胞菌[18]、惡臭假單胞菌[1921]、棲稻黃色假單胞菌[22]、沼澤紅假單胞菌[23]、草假單胞菌[24]、摩氏假單胞菌[25]、地中海假單胞菌[26]等不同種的微生物均能分泌鐵載體，且主要為兒茶酚型鐵載體。此外，研究者們還從醋酸鈣不動(dòng)桿菌[27]、鮑曼不動(dòng)桿菌[28]、溶血不動(dòng)桿菌[29]、約氏不動(dòng)桿菌[30]、嗜油不動(dòng)桿菌[31]和皮氏不動(dòng)桿菌[32]等不動(dòng)桿菌屬微生物中篩選到分泌型鐵載體產(chǎn)生菌，并對(duì)所產(chǎn)鐵載體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和形式作了詳細(xì)的解析。目前，有關(guān)歐文氏菌屬分泌鐵載體的研究還較少，僅發(fā)現(xiàn)胡蘿卜軟腐歐文氏菌[33]、解淀粉歐文氏菌[34]、菊歐文氏菌[35]和草生歐文氏菌[36] 4個(gè)種的微生物能分泌合成鐵載體。

本研究從植物病原菌中篩選高產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢(shì)菌株，以期解析分泌型鐵載體在植物體內(nèi)或根際土壤中的響應(yīng)機(jī)制，以及分泌型鐵載體介導(dǎo)的寄主與病原互作機(jī)制，為植物病害防治提供新的作用靶點(diǎn)，同時(shí)也在生防菌的開發(fā)應(yīng)用等方面具有重要的實(shí)踐意義。

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（責(zé)任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190317?? 修訂日期： 20190512

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31600349，31660600，31760019）;國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201503119-03-02）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

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