1株高產(chǎn)鐵載體菌株的篩選鑒定以及化感作用的驗證

曹宏麗，郝尚華，楚夢曉，邱爽，羅夢香，王明道

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南 鄭州 450002)

鐵(Fe)是植物生長必需的礦物營養(yǎng)元素，在植物的呼吸作用、光合作用以及氮代謝中起著重要的作用。在中國，土壤中的全鐵含量較高，但大多以難溶的氧化鐵形式存在，有效態(tài)鐵含量較低，僅為總量的千分之一甚至萬分之一[1-2]。施肥會影響土壤中營養(yǎng)含量的變化，特別是中性及弱堿性土壤，該類土壤含有大量的錳、銅、鋅等微量元素，嚴重缺鉀或施用大量廄肥、磷肥都會導(dǎo)致該類土壤中嚴重缺鐵[3]。由于植物只能吸收利用土壤中有效態(tài)鐵，因此，為了滿足植物生長發(fā)育需求，提高土壤中有效態(tài)鐵的含量就十分重要。當(dāng)植物遭受缺鐵脅迫時，根系被誘導(dǎo)向根際環(huán)境分泌大量有機小分子化合物來提高鐵的有效性[4]。這種根系分泌物能夠改變根際土壤的理化性質(zhì)，提高礦物養(yǎng)分的生物有效性，還可以作為微生物碳源、氮源和營養(yǎng)物質(zhì)促進植物生長。此外，根系分泌物還可以選擇性改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量[5]。金崇偉[6]將紅三葉草在缺鐵土壤以及人為添加植物根系分泌物土壤進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，2種土壤中微生物群落都發(fā)生變化，其中，產(chǎn)鐵載體(siderophores)能力強的微生物數(shù)量劇增。鐵載體是大多數(shù)細菌和真菌在鐵脅迫狀態(tài)下，通過體內(nèi)合成和分泌的能與Fe3+特異性緊密螯合成螯合物的小分子化合物。鐵載體通過提高鐵的生物有效性來滿足自身生長需求[7]。鐵載體按照螯合基團類型可分為兒茶酚型、α-羥基羧酸型(又稱檸檬酸型)和異羥肟酸型[8]。目前，國內(nèi)外對分泌鐵載體的植物根際促生菌以及植物內(nèi)生菌等研究較多[9-10]。然而，細菌在生長代謝和快速繁殖過程中，為了獲得鐵元素而分泌出的各種類型鐵載體，對于植物而言就成為了強有力的毒力因子。細菌會與植物競爭性攝取有限的鐵資源，干預(yù)植物的鐵吸收，甚至利用植物中的鐵，嚴重影響植物的正常生長[11]。王國慶等[12]研究發(fā)現(xiàn)，地黃含有大量的鐵元素，在干地黃中鐵含量高達2.4 mg·kg-1，而種植地黃的堿性土壤中有效鐵含量小于2.3 mg·kg-1。有限的鐵元素會導(dǎo)致細菌大量分泌鐵載體，從而對植物造成生物化感作用[13]。生物化感會對地黃造成連作障礙，導(dǎo)致土地在種植地黃1 a之后，要等8～10 a才可以再次種植[14]，并且重茬地黃味苦形瘦，不宜入藥，嚴重阻礙道地產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟發(fā)展和地黃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[15-16]。

因此，本研究從飽受連作障礙影響的地黃入手，從種植過地黃的3種土壤中分離出1株高產(chǎn)鐵載體菌株，對其進行形態(tài)學(xué)觀察以及生理生化鑒定，鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida) S2，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化該菌的產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件。由于懷地黃是異花授粉植物，其種子不能留種，在實際生產(chǎn)中多以塊根營養(yǎng)繁殖[17]，而擬南芥植株較小、生長周期短且形態(tài)特征分明，更適合判斷鐵載體對植物根的影響，因此，本研究選用擬南芥作為生物測定的植物材料，通過分析S2菌株所產(chǎn)鐵載體對擬南芥主根的生物化感作用，以期為解決植物連作障礙提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取材方法 采用“5點取樣法”，在河南南陽新野縣地黃種植大田(種植地黃期間未種植其他作物)，分別取地黃頭茬土(T)、重茬土(C)和三茬土(S)，共3個土樣。

1.1.2 生物檢測材料 以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室保存的擬南芥DR5:GUS 種子為生物測定材料。

1.1.3 儀器與試劑 DHP-9082d型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)；IS-RDV1型立式恒溫搖床(美國精騏有限公司)；MEGAFUGE 8R型高速冷凍離心機(Thermo scientific公司)；ARKTIK Thermal Cycler PCR儀(Thermo scientific公司)。AXIO光學(xué)顯微鏡(歐波有限公司)；DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；MS粉(Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins，Phyto Technology Laboratories)。薄層色譜硅膠板(GF254)、柱層析硅膠(75～150 μm)、XAD-2大孔吸附樹脂購自青島海洋化工有限公司；明膠、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)、鉻天青購于天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉購于北京索萊寶科技有限公司；無水哌嗪購于上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑采購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 CAS檢測液：(1)母液：10 mmol·L-1十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)，1 mmol·L-1FeCl3加83 μL HCl 混勻，2 mmol·L-1鉻天青；(2)1.5 mL FeCl3混合液與7.5 mL鉻天青、6.0 mL HDTMA、4.307 g無水哌嗪溶于30 mL去離子水，加6.25 mL HCl后定容至100 mL。

CAS培養(yǎng)基：蔗糖 2 g，酸水解酪蛋白(SOLARBIO)3 g，磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH6.8)5 mL，CaCl2(1 mmol·L-1)1 mL，CAS 檢測液250 mL，瓊脂粉40 g，去離子水補足1 L；121 ℃滅菌30 min。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH值7.0，去離子水補足1 L。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20 g。

培養(yǎng)基A(KMB培養(yǎng)基)：丙三醇15 mL，無鐵酪蛋白氨基酸5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，去離子水定容到1 L。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉18 g。培養(yǎng)基B(富鐵KMB培養(yǎng)基)：在培養(yǎng)基A(1 L)基礎(chǔ)上加入FeSO4·7H2O共0.027 8 g。MS培養(yǎng)基：MS粉2.2 g，蔗糖10 g，調(diào)pH值至5.78～5.82，添加瓊脂粉10 g，去離子水1 L，高壓蒸汽滅菌121 ℃、30 min。

1.2 土壤中產(chǎn)鐵載體菌株的分離以及高產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

將3種土樣(T、C、S)各10 g分別加入含90 mL無菌水和玻璃混勻珠的250 mL三角瓶中，震蕩15 min制成菌懸液；采用涂布分離法，于無菌條件下，取3個稀釋度(10-1、10-2、10-3)溶液各100 μL通過無鐵涂布棒涂布在CAS平板上；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h；待有菌落出現(xiàn)，觀察菌落數(shù)，挑取菌落周圍產(chǎn)生明顯的橙(棕)黃色鐵螯合圈的菌落，挑選此菌落反復(fù)劃線分離，獲得純菌株，轉(zhuǎn)接在LB斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆?。用無鐵接種環(huán)將產(chǎn)鐵載體菌株從LB斜面培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)基A(5mL)中，在恒溫震蕩箱中28 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h進行活化。

1.3 菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定以及生物化感作用測定

1.3.1 菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定 菌株產(chǎn)鐵載體能力以其產(chǎn)鐵載體含量計。將活化的菌種取0.5 mL轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B(50 mL)中擴培36 h，取12株初篩菌株對應(yīng)的培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B菌液用在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，保留上清液。V(培養(yǎng)基上清液)∶V(CAS檢測液)=1∶1混合反應(yīng)10 min后，在OD630下，以去離子水為對照，按照下列公式計算鐵載體含量：

Su=(Ar-A)/Ar×100%

(1)

式中：Su為鐵載體含量；Ar為所測培養(yǎng)基B上清液的OD值；A為所測培養(yǎng)基A上清液的OD值。

1.3.2 鐵載體生物化感作用測定 菌株用培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B培養(yǎng)后，在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min得5 mL對應(yīng)上清液，分別加入100 mL MS培養(yǎng)基中，空白對照(CK)不加上清液，將適量的擬南芥種子用體積分數(shù)2.5%次氯酸鈉浸泡消毒10 min后用無菌水沖洗3遍，以1次數(shù)1顆種子為宜。在凝固的MS培養(yǎng)基1/3處點擬南芥種子，種子在1條水平線上并保持合適的距離，點好的擬南芥種子在4 ℃條件下春化2 d，之后取平板垂直插放于平板架，使橫排種子平行于地面，在22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后測擬南芥主根根長度。

1.4 高產(chǎn)鐵載體菌株的鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定 參照文獻[18]通過細菌的革蘭氏染色法對篩選到的高產(chǎn)鐵載體菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 將待鑒定菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，于4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min后回收菌體，提取菌株基因組。DNA的提取與純化參照MARMUR法[19]及氯仿-苯酚混合法[20]，用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增，委托江蘇金唯智生物科技有限公司進行DNA測序，將獲得的序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對分析。

1.4.3 菌株的生理生化鑒定 參照HOLT等[21]的方法進行菌株生理生化鑒定。

1.5 高產(chǎn)鐵載體菌株產(chǎn)鐵載體條件的優(yōu)化

1.5.1 高產(chǎn)鐵載體菌株生長曲線測定以及培養(yǎng)時間確定 高產(chǎn)鐵載體菌株于28 ℃、200 r·min-1條件下在50 mL培養(yǎng)基A中培養(yǎng)12 h，之后取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到100 mL培養(yǎng)基A中(設(shè)置3個重復(fù))，0～16 h每隔2 h取1次樣，待菌株生長穩(wěn)定后在24、36、48 h各取1次樣，在OD600條件下進行測定。對應(yīng)生長曲線的鐵載體含量按1.3.1的方法進行測定，并結(jié)合生長曲線確定菌株的培養(yǎng)時間。

1.5.2 高產(chǎn)鐵載體菌株產(chǎn)鐵載體單因素試驗 取活化的高產(chǎn)鐵載體菌株0.5 mL轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B中，考察溫度(24、26、28、30、32、34、36、38 ℃)、轉(zhuǎn)速(120、140、160、180、200、220 r·min-1)、pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對其產(chǎn)鐵載體能力的影響。

1.5.3 高產(chǎn)鐵載體菌株產(chǎn)鐵載體正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取溫度(26、28、30℃)(A)、轉(zhuǎn)速(160、180、200 r·min-1)(B)、pH值(8.0、9.0、10.0)(C)為因素，設(shè)計成3因素3水平菌株S2產(chǎn)鐵載體的正交試驗，因素水平如表1所示。

表1 高產(chǎn)鐵載體菌株產(chǎn)鐵載體正交試驗設(shè)計Table 1 Design of orthogonal experiment of high-yielding siderophore strain siderophore-producing

1.6 鐵載體的分離純化以及生物化感測定

1.6.1 大孔吸附樹脂分離鐵載體結(jié)果 取高產(chǎn)鐵載體菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min。用XAD-2大孔吸附樹脂動態(tài)吸附上清液，之后經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)25%，50%，75%和100%甲醇溶液梯度洗脫樹脂，洗脫液用薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)[22]進行檢測，展開條件為V(無水乙醇)∶V(NaOH(1 mol·L-1))∶V(水)=1∶0.5∶8.5。

1.6.2 硅膠柱層析分離鐵載體結(jié)果 取經(jīng)XAD-2初步純化后的鐵載體樣品進一步硅膠純化。采用干法上樣[23]稱硅膠1 g與3 mL 待純化樣品攪拌均勻，60 ℃干燥后裝入層析柱樣品層，厚度為0.5 cm。按照無水乙醇、V(無水乙醇)∶V(水)=2∶8、V(無水乙醇)∶V(NaOH(1 mol·L-1))∶V(水)=1∶0.5∶8.5、V(無水乙醇)∶V(NaOH(1 mol·L-1))∶V(水)=0.5∶0.5∶9共4個極性梯度進行層析，每10 mL為1管，通過TLC法檢測純化效果。

1.6.3 純化鐵載體生物化感作用驗證 取純化后的鐵載體2 mL與空白土浸液混合配制MS培養(yǎng)基進行擬南芥的生物測定，以空白土和純化鐵載體為對照，以抑制擬南芥主根根長度為檢測鐵載體抑制作用的依據(jù)，具體參考1.3.2方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

在Design-Export軟件上進行作圖及統(tǒng)計分析，顯著性分析采用Duncan法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)鐵載體菌株的分離以及高產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

以CAS平板上菌落周圍產(chǎn)生橙(棕)黃色鐵螯合圈為篩選產(chǎn)鐵載體菌株的依據(jù)，從T、C、S這3種土壤中粗篩分離到20株產(chǎn)鐵載體菌株；分離純化后，通過對菌株外觀形態(tài)的觀察，每種土樣各4株，分別命名為T1、T2、T3、T4、C1、C2、C3、C4、S1、S2、S3以及S4。

2.2 純化菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定

2.2.1 初篩菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定 對初步篩選出的12株產(chǎn)鐵載體細菌進行產(chǎn)鐵載體能力的定量檢測，結(jié)果見圖1。從這12株產(chǎn)鐵載體細菌中篩選到7株Su值在50%以上的產(chǎn)鐵載體能力較強的菌株，按照產(chǎn)鐵載體能力從大到小排序，分別為C4、S1、S2、S3、T2、C2以及T3。

注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05。下同。Note：Different lowercase letters indicate significant differences,P<0.05.The same as below.

2.2.2 初篩菌所產(chǎn)鐵載體的生物化感測定 對篩選出的7株高產(chǎn)鐵載體細菌的上清液進行生物化感作用的檢測，結(jié)果見圖2。菌株S2的含鐵載體培養(yǎng)基A上清液相對于不含鐵載體的培養(yǎng)基B上清液對擬南芥主根生長長度有顯著抑制效果，其他菌株不明顯，說明菌株S2的鐵載體培養(yǎng)液上清對擬南芥的主根生長產(chǎn)生了生物化感作用。接下來以菌株S2為目標(biāo)，對其進行菌株鑒定。

圖2 高產(chǎn)菌株鐵載體的化感作用檢測結(jié)果Fig.2 The allelopathy detection results of siderophores of high yield strains

2.3 高產(chǎn)鐵載體菌株的鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 菌株S2鏡檢以及平板觀察結(jié)果如圖3所示。菌株S2呈短桿形紅色，是革蘭氏陰性細菌；在CAS平板上有較大且明顯的橙(棕)黃色鐵載體螯合圈，說明菌株S2產(chǎn)鐵載體能力很強；在培養(yǎng)基A平板上，菌株S2分泌出帶有熒光的黃綠色素，該黃綠色素為青膿素(pyoverdine)。假單胞菌產(chǎn)生的青膿素可以用培養(yǎng)基A鑒定，推測菌株S2屬于假單胞菌屬。

注：A：菌株S2株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(100×10)；B：菌株S2CAS平板培養(yǎng)；C：菌株S2培養(yǎng)基A平板培養(yǎng)。Note:A:Microscopic staining results of S2 strain by Gram’s(100×10)；B:S2 strain CAS plate culture；C:S2 strain medium A plate culture.

2.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 對菌株S2的全基因組DNA及其PCR產(chǎn)物的葡聚糖凝膠電泳檢測，將菌株S2的PCR產(chǎn)物送去江蘇金唯智生物科技有限公司測序。用NCBI-BLAST軟件，對該菌株序列進行同源檢索發(fā)現(xiàn)，如表2所示，菌株S2為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

表2 高產(chǎn)鐵載體菌株S2的分子鑒定結(jié)果Table 2 Molecular identification of siderophore-producing S2 strain

2.3.3 菌株的生理生化實鑒定 假單胞菌屬中的熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌3種假單胞菌都可以分泌青膿素，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24]中銅綠假單胞菌能還原硝酸鹽且在42 ℃生長、熒光假單胞菌能在4 ℃生長和液化明膠的特性，對菌株S2進行還原硝酸鹽試驗以及明膠液化試驗，結(jié)果見圖4所示。菌株S2還原硝酸鹽試驗為陰性，未產(chǎn)生氮氣，不能在42 ℃生長，且明膠液化試驗結(jié)果中也為陰性，不能在4 ℃生長。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗以及分子生物學(xué)結(jié)果，確定并命名該菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)S2。

2.4 菌株S2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 菌株生長曲線測定以及培養(yǎng)時間確定 菌株S2在液體培養(yǎng)基A中生長曲線及對應(yīng)鐵載體含量測定結(jié)果如圖5所示。由于菌株S2在12 h處于的穩(wěn)定的對數(shù)生長期，因此選取12 h、OD600=1.31的菌液作為種子；隨著培養(yǎng)時間的增加，在36～48 h時Su值穩(wěn)定且此時鐵載體量較高，故選擇48 h作為菌株S2產(chǎn)鐵載體的最適培養(yǎng)時間。

注：A：1,硝酸鹽空白培養(yǎng)基；2～4，還原硝酸鹽試驗結(jié)果；B：1,明膠空白培養(yǎng)基；2～4，菌株S2明膠液化試驗結(jié)果。Note:A:1,nitrate blank medium;2-4,test results of nitrate reduction by S2 strain;B:1,gelatin blank medium;2-4,test results of gelatin liquefaction by S2 strain.

2.4.2 菌株S2鐵載體產(chǎn)量單因素試驗 從圖6可以看出，溫度對菌株S2產(chǎn)鐵載體能力影響相對較大。溫度在28 ℃時，Su值最大為76.15%；當(dāng)溫度達到38 ℃時，Su值低至16.32%，因此，高溫會影響菌株S2產(chǎn)鐵載體能力。從圖7可以看出，轉(zhuǎn)速對菌株S2產(chǎn)鐵載體能力影響相對較大。轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時Su值最大,為60.73%，而轉(zhuǎn)速達到220 r·min-1時，Su值最小,為1.64%，因此，保持較低速有利于菌株S2產(chǎn)鐵載體。從圖8可以看出，培養(yǎng)基pH值為堿性時，Su值均在50%以上，pH值為9.0時Su值為71.56%，pH值為10.0時Su值為76.08%，因此，當(dāng)pH值在8.0～10.0之間時，有利于菌株S2產(chǎn)鐵載體。

圖5 菌株S2產(chǎn)鐵載體能力的檢測結(jié)果及生長曲線Fig.5 The detection results to produe siderophores of the iron ability of S2 strain

2.4.3 S2產(chǎn)鐵載體能力正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定S2菌產(chǎn)鐵載體的最佳條件,試驗結(jié)果如表3所示。菌株S2產(chǎn)鐵載體的最佳條件是A2B1C3，即最佳條件為溫度為26 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1、pH 值為 10.0，此時Su值最大為64.37%，S2菌株產(chǎn)載體能力最強。通過極差R可知，影響菌株產(chǎn)鐵載體量的主要因素是pH值，其次是溫度，然后是轉(zhuǎn)速。

圖6 不同溫度下菌株S2產(chǎn)鐵載體能力的檢測結(jié)果Fig.6 The detection results of S2 strain to produce siderophores ability at different temperatures

圖7 不同轉(zhuǎn)速下菌株S2產(chǎn)鐵載體能力的檢測結(jié)果Fig.7 The detection results of S2 strain to produce siderophores ability at different speeds

圖8 不同pH值下菌株S2產(chǎn)鐵載體能力的檢測結(jié)果Fig.8 The detection results of S2 strain to produce siderophores ability at different pH values

表3 鐵載體含量正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test design and results of siderophore content

2.5 鐵載體的分離純化與生物化感測定

2.5.1 大孔吸附樹脂分離鐵載體結(jié)果 由圖9可知，經(jīng)XAD-2大孔吸附樹脂吸附后，菌株S2鐵載體混合溶液中已檢測不到鐵載體，說明鐵載體完全被吸附。經(jīng)過不同梯度甲醇溶液的洗脫，使難以展開的混合鐵載體分離開，但仍然存在拖尾，說明單一使用大孔吸附樹脂吸附分離純化鐵載體效果不佳。鐵載體主要在體積分數(shù)25%甲醇洗脫相中，繼續(xù)用硅膠純化該洗脫相中的鐵載體。

注：1：菌株S2鐵載體溶液；2：樹脂吸附后的菌株S2鐵載體溶液；3：體積分數(shù)25%甲醇洗脫相；4：體積分數(shù)50%甲醇洗脫相；5：體積分數(shù)75%甲醇洗脫相；6：體積分數(shù)100%甲醇洗脫相。Note:1:S2 strain iron carrier solution;2:S2 strain iron carrier solution after resin adsorption;3:25% methanol elution phase;4:50% methanol elution phase;5:75% methanol elution phase; 6:100% methanol elution phase.

2.5.2 硅膠柱層析分離鐵載體結(jié)果 將硅膠用4個極性梯度進行純化后，經(jīng)過TLC檢測，結(jié)果表明，在V(無水乙醇)∶V(水)=2∶8的極性中存在鐵載體，將該梯度洗脫液的9個管進行TLC檢測，結(jié)果如圖10所示，可以明顯看到含有2種發(fā)出熒光的鐵載體，大極性載體集中在第4～9管，小極性載體集中在2管。將4～9管合為d管，處理后再次檢測，結(jié)果如圖11所示，在b管和d管(4～9合管)中，2種極性的鐵載體已完全分離開。

圖10 硅膠純化菌株S2所產(chǎn)鐵載體的TLC檢測結(jié)果Fig.10 The TLC detection results of S2 strain siderophoves purified on silica gel

注：a～c：鐵載體硅膠純化分離的1～3管；d：鐵載體硅膠純化分離的合管(4～9管)。Note:a-c:siderophore silica gel purification and separation of 1-3 tubes;d:combined tube for purification and separation of siderophore silica gel (4-9 tubes).

2.5.3 純化鐵載體生物化感作用驗證 對純化后的小極性鐵載體和大極性鐵載體進行擬南芥生物檢測，驗證菌株S2純化鐵載體對擬南芥主根生長的化感作用，結(jié)果如圖12所示。擬南芥主根受單一純化的鐵載體影響主根根長度為1.80 cm，受空白土浸液影響主根根長度為1.55 cm，而當(dāng)純化鐵載體與空白土浸液混合后，大極性鐵載體對擬南芥主根生長產(chǎn)生了極顯著抑制，擬南芥主根根長度變?yōu)?.76 cm，說明大極性鐵載體對擬南芥主根生長具有明顯生物化感作用。

圖12 菌株S2純化鐵載體的化感作用驗證Fig.12 The allelopathy validation results of the of S2 strain purified siderophores

3 結(jié)論和討論

本研究在種植過地黃的3種土壤中分離得到1株高產(chǎn)鐵載體菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA同源性分析以及生理生化測試，鑒定菌株S2為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。通過正交試驗優(yōu)化了菌株產(chǎn)鐵載體的條件，在26 ℃、180 r·min-1、pH值為10.0條件下，培養(yǎng)時間48 h時，其產(chǎn)鐵載體含量最大為64.37%。WENDENBAUM等[25]。惡臭假單胞菌是高產(chǎn)鐵載體的優(yōu)勢菌株，這與本研究結(jié)果一致。此外，惡臭假單胞菌可以通過分泌鐵載體與植物競爭鐵營養(yǎng)；如果在病原細菌生長環(huán)境中施加強螯合劑EDTA，與細菌競爭Fe3+，可以有效抑制惡臭假單胞菌的生長[25]。惡臭假單胞菌可以分泌2種鐵載體：一種是酚鹽鐵載體(pyochelin)，與鐵的結(jié)合系數(shù)較低；另一種是熒光鐵載體(pyoverdine)，呈黃綠色，能在365 nm紫外光下發(fā)出熒光[26]。本研究分離得到的惡臭假單胞菌S2，可以分泌2種鐵載體，一種是小極性鐵載體，一種是大極性鐵載體，而這2種鐵載體均可以在365 nm下觀察到，因此本研究分離的鐵載體均為熒光鐵載體。

目前，關(guān)于鐵載體的研究大多集中在其生物合成的機制以及抑制病原菌的研究上，對于鐵載體的生物化感作用的研究較少。謝小軍[27]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚型鐵載體對小麥和水稻胚根有非常顯著抑制作用。李曼[28]通過對處于對數(shù)生長期的藻細胞添加不同濃度的鐵載體發(fā)現(xiàn)，鐵載體濃度對藻細胞的抑制程度呈線性關(guān)系，濃度越大，抑制作用越強烈。本研究通過TLC對分離純化后的鐵載體展開觀察，在紫外燈照射下檢測分離純化效果，并將純化后的鐵載體進行生物化感檢測，結(jié)果表明，純化后的鐵載體、空白土浸液對擬南芥主根的作用無差別，但是純化鐵載體與空白土浸液的混合溶液對擬南芥有明顯抑制效果，根長度由1.80 cm減小到0.76 cm?；凶饔檬窃斐傻攸S連作障礙的重要原因之一，關(guān)于這方面的研究大多集中在地黃分解產(chǎn)生的萜類、醇、醛、酚類、有機酸等有機化合物上[29-31]，關(guān)于微生物分泌產(chǎn)生化感物質(zhì)從而對地黃造成生物化感作用的研究較少。本研究分離得到惡臭假單胞菌S2，其分泌的鐵載體證實可以與土壤共同作用于植物，對植物的生長造成毒害作用，推測這是造成地黃連作障礙的原因。