美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-LAMP 可視化快速檢測方法的建立與應(yīng)用

（北京市動物疫病預防控制中心，北京 102629）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸性傳染病，俗稱“豬藍耳病”。PRRS 1987 年首次暴發(fā)于美國，隨后相繼在加拿大以及歐洲和亞洲國家出現(xiàn)，目前已在世界范圍內(nèi)流行[1]。患病母豬通常表現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)以及死胎數(shù)增加等不良臨床癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失[2]。PRRSV 容易變異、毒株多樣、感染時間長，因此防控難度較大[3-4]。1995 年我國首次發(fā)現(xiàn)PRRS。2006 年我國全面暴發(fā)了以體溫高、發(fā)病率高、死亡率高為主要臨床特征的豬“高熱病”，而導致該病的病原是高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HPPRRSV）。

PRRSV 為單股正鏈RNA 病毒。根據(jù)病毒基因組及血清型特性，可將PRRSV 劃分為兩種基因型，即以LV 株為代表的基因1 型（歐洲型）和以VR2332 株為代表的基因2 型（美洲型）。我國主要流行基因2 型（美洲型）毒株。PRRS 的傳播方式主要有接觸傳播、空氣傳播、精液傳播以及垂直傳播，病豬、帶毒豬和患病母豬所產(chǎn)的仔豬，以及被污染的環(huán)境、用具等都是重要的傳染源。各種品種、年齡和用途的豬均可被感染，但以妊娠母豬和1 月齡以內(nèi)的仔豬最易感。40 日齡以內(nèi)仔豬的PRRS 病死率可高達100%，育肥豬病死率約為50%；在一些地區(qū)的豬場，PRRS 的發(fā)病率可接近100%，病死率為30%～50%，有的可達80%以上[5]。PRRS 發(fā)病沒有明顯的季節(jié)性，各個季節(jié)均可發(fā)病，而且發(fā)病迅速，短期內(nèi)便可波及全群或鄰近群。因此，在臨床上我國迫切需要一種能夠快速診斷美洲型PRRSV 毒株的檢測方法。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸體外等溫擴增技術(shù)，利用鏈置換型DNA 聚合酶，在恒溫條件下進行擴增反應(yīng)，可在15～60 min 內(nèi)實現(xiàn)109～1010倍的擴增[6]，具有快速、特異、精確、簡便等特點[7]。LAMP 反應(yīng)能產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物，即焦磷酸鎂白色沉淀，通過添加鈣黃綠素（螯合劑）肉眼觀察有無黃綠色熒光，即可判斷靶基因是否存在。與常規(guī)PCR 相比，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，只需要一個簡單的恒溫裝置，即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，并且可與各種系統(tǒng)結(jié)合，在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR 技術(shù)，而檢測成本卻遠低于熒光定量PCR[8-10]。

本研究根據(jù)GenBank 中美洲型PRRSV 經(jīng)典毒株JXA1 序列，通過在線生物設(shè)計軟件設(shè)計合成LAMP 引物，同時在LAMP 技術(shù)的基礎(chǔ)上添加了熒光，建立了美洲型PRRSV（NA-PRRSV）RTLAMP 可視化快速檢測方法。該方法無需后續(xù)的電泳檢測，可直接在儀器上檢測熒光或者肉眼判定，因而提高了檢測的靈敏度，為NA-PRRSV 的快速、準確鑒別提供了有效手段。

1 材料

1.1 菌（毒）株及相關(guān)試驗材料

美洲型JXA1、VR2332、類NADC30 毒株，歐洲型LV 株以及豬健康細胞培養(yǎng)物，均由中國農(nóng)業(yè)大學動物流行病學與人畜共患病重點實驗室惠贈；豬瘟活疫苗C 株，購自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬偽狂犬病毒Bartha-K61 株，購自瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司；豬圓環(huán)病毒2 型DNA 基因組，由本實驗室保存。陽性質(zhì)控標準品，為含有美洲型經(jīng)典毒株基因組RNA 的提取液，陰性質(zhì)控標準品為無RNA 酶蒸餾水，均由本實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑耗材和設(shè)備

核糖核酸擴增試劑盒（生產(chǎn)批號87001）、熒光目視檢測試劑盒（生產(chǎn)批號94001）、loopamp?實時濁度測定儀器，均購自榮研生物科技（中國）有限公司；無RNA 酶蒸餾水（生產(chǎn)批號N10108），購自北京索萊寶科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（生產(chǎn)批號20200101），購自杭州博日科技有限公司；PRRSV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒（生產(chǎn)批號HPRRS20180524P），購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；熒光定量PCR 儀ABI Quant Studio7，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TGuide S32 全自動核酸提取純化儀，購自天根生化科技有限公司；移液器，購自德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 引物合成

根據(jù)GenBank 已發(fā)表的美洲型經(jīng)典毒株JXA1序列（GenBank：EF112445.1），運用在線生物軟件（http://primerexplorer.jp/），通過調(diào)整Tm 值、GC 含量、dG 臨界值、擴增長度和片段區(qū)域等參數(shù)，設(shè)計適用于RT-LAMP 的特異性外引物和內(nèi)引物。通過試驗篩選出最佳外引物和內(nèi)引物，并在此引物組基礎(chǔ)上，設(shè)計最佳環(huán)引物，最終得到本研究的引物組合（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

2.2 核酸提取

按照磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提供的操作方法，對美洲型 JXA1、VR2332、類NADC30 毒株，歐洲型毒株LV 株以及豬健康細胞培養(yǎng)物，豬瘟活疫苗C 株、豬圓環(huán)病毒2 型DNA基因組，豬偽狂犬病毒Bartha-K61株進行核酸提取，提取產(chǎn)物置-40 ℃冰箱保存。

2.3 反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)體系建立 在loopamp?實時濁度測定儀器上，使用設(shè)計的引物組合進行LAMP 擴增。擴增反應(yīng)體系為25 μL：RT-LAMP預混液18 μL（2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL、5 μmol/L 的外引物F3 1 μL、5 μmol/L 的外引物B3 1 μL、40 μmol/L 的內(nèi)引物FIP 1 μL、40 μmol/L 的內(nèi)引物BIP 1 μL、20 μmol/L的環(huán)引物LB 1 μL、無RNA 酶蒸餾水0.5 μL）、酶溶液1 μL、熒光目視檢測試劑1 μL 和RNA 樣品5 μL。同時設(shè)置陰、陽性對照。擴增反應(yīng)工作程序為：65 ℃、45 min。檢測結(jié)果判定：呈現(xiàn)綠色或有特定擴增曲線為陽性，呈現(xiàn)橘黃色或無特定擴增曲線為陰性。

2.3.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化 以美洲型JXA1、VR2332、類NADC30 毒株提取的核酸（10 ng/μL）為模板，利用建立的LAMP 反應(yīng)體系，在loopamp?儀器上進行擴增，設(shè)置58、60、63、65 ℃等溫度進行篩選。擴增反應(yīng)工作程序為65 ℃、45 min。

2.4 引物特異性驗證

選用美洲型 JXA1、VR2332、類NADC30 毒株以及歐洲型LV 毒株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒和豬健康細胞培養(yǎng)物提取核酸，在loopamp?實時濁度測定儀器上，利用建立的LAMP反應(yīng)體系，對設(shè)計的引物組合（表1）進行特異性驗證。擴增反應(yīng)工作程序為65 ℃、120 min。

2.5 靈敏度試驗

將JXA1 毒株提取核酸，經(jīng)數(shù)字PCR 定量為104copies/μL，進行10 倍倍比稀釋后，分別進行RT-LAMP 和real-time PCR 擴增，檢測靈敏度。

RT-LAMP總擴增反應(yīng)體系為25 μL：RTLAMP 預混液18 μL、酶溶液1 μL、熒光目視檢測試劑1 μL 和RNA 樣品5 μL。擴增反應(yīng)工作程序為65 ℃、45 min。

實時熒光RT-PCR 反應(yīng)體系：按照PRRSV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒使用說明書進行操作。

2.6 特異性試驗

用建立的LAMP 反應(yīng)體系，分別以美洲型VR2332 株、JXA1 株、類NADC30 株，歐洲型LV株以及豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒、豬健康細胞培養(yǎng)物等提取的核酸為模板進行試驗，驗證反應(yīng)體系的特異性。

2.7 臨床樣品檢測

將已知背景的30 份臨床樣品（22 份陰性、8份陽性）按要求處理后，分別進行RT-LAMP 和實時熒光RT-PCR 擴增，分析兩種檢測結(jié)果的符合率。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物特異性驗證

引物特異性擴增結(jié)果如圖1 所示：美洲型JXA1（編號1）、VR2332（編號2）、類NADC30（編號3）毒株均在30 min 內(nèi)檢出，歐洲型LV 毒株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒和豬健康細胞培養(yǎng)物（編號4～8）在120 min 內(nèi)均未檢出，表明篩選的引物組合具有較高的擴增效率和特異性。

圖1 不同毒株在同種引物下的擴增效率

3.2 反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

試驗結(jié)果顯示，以美洲型JXA1、VR2332、類NADC30 毒株提取的核酸為模板，當退火溫度為65 ℃時，引物的擴增效率最高，因此確定65 ℃為最佳退火溫度。最終反應(yīng)體系為25 μL：RTLAMP 預混液18 μL、酶溶液1 μL、熒光目視檢測試劑1 μL 和RNA 樣品5 μL。擴增反應(yīng)工作程序為65 ℃、45 min。

3.3 靈敏度試驗

RT-LAMP 檢測結(jié)果（圖2）顯示，管1～4 均為陽性（顯示綠色），即該方法的檢測最低限為10 copies/μL，與實時熒光RT-PCR 檢測靈敏度（圖3）基本一致。

圖2 PRRSV 靈敏度試驗檢測結(jié)果

圖3 PRRSV 實時熒光RT-PCR 檢測結(jié)果

3.4 特異性試驗

引物組合制備的試劑盒特異性檢測結(jié)果（圖4）顯示：該檢測方法可以成功檢測出美洲型的VR2332 株、JXA1 株、類NADC30 株（分別對應(yīng)管1～3），歐洲型LV 株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒和豬健康細胞培養(yǎng)物均未檢出（分別對應(yīng)管4～8），表明本檢測方法具有良好的特異性。

圖4 試劑盒特異性檢測結(jié)果

3.5 臨床檢測試驗

將采集的30 份病料，提取核酸后分別進行RT-LAMP 方法與實時熒光RT-PCR 方法檢測。結(jié)果（表2）顯示，所建立的RT-LAMP 方法與熒光定量RT-PCR 方法檢測結(jié)果一致，符合率為100%，但RT-LAMP 擴增時間（45 min）比實時熒光RT-PCR（80 min）短，說明建立的RT-LAMP檢測方法特異性好、靈敏度高、方便快捷、結(jié)果準確可靠。

表2 RT-LAMP 與實時熒光RT-PCR 方法檢測結(jié)果比對單位：份

4 討論

PRRS 是一種豬的高度接觸性傳染病，1995 年在我國首次出現(xiàn)，1996 年首次在我國分離到病原，隨后在我國迅速蔓延[11]。2006 年我國全面暴發(fā)了由HP-PRRSV 導致的PRRS 疫情。該毒株較之前國內(nèi)流行的經(jīng)典美洲型毒株出現(xiàn)了NSP2缺失[12]，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的沖擊。PRRS 臨床癥狀與豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒感染相似，且常呈混合感染，導致確診困難。

傳統(tǒng)的PRRSV 檢測方法主要包括病毒分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、間接免疫熒光試驗（IFA）和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA）等[13]。目前最常用的核酸檢測方法有常規(guī)PCR 和熒光定量PCR 等。傳統(tǒng)的PRRSV 檢測方法存在需要使用高成本儀器設(shè)備，試驗所需時間較長等不足。RT-PCR 和實時熒光RT-PCR 雖然較以往方法具有特異性更強、靈敏度高、重復性好，且自動化程度高等優(yōu)點，但是對于操作人員的分子生物學技術(shù)背景要求很高，試劑成本很貴，難以在基層實際生產(chǎn)中普及應(yīng)用。

2000 年環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）由日本學者 Notomi 等[14]在《Nucleic Acids Res》雜志上公開介紹，隨即受到了世界衛(wèi)生組織（WHO）、各國學者和相關(guān)政府部門的關(guān)注。LAMP 技術(shù)作為一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，具有快速、特異、敏感、簡便等優(yōu)點，因而在核酸快速檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。LAMP 方法的優(yōu)勢除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分簡單，在應(yīng)用階段對儀器的要求低，結(jié)果判讀也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光即可，不像普通PCR 方法需要進行凝膠電泳觀察結(jié)果，因而是一種適合現(xiàn)場、基層快速檢測的方法。而且此方法的結(jié)果判斷均不需要開蓋檢測，從而很好地避免了擴增產(chǎn)物污染，也適用于實驗室相關(guān)研究[15]。

本研究針對美洲型PRRSV 經(jīng)典毒株JXA1 序列，建立了熒光可視化的RT-LAMP 檢測方法，證實可有效快速檢測美洲型PRRSV。該方法靈敏性和特異性良好，最低檢測限為10 copies/μL。同時RT-LAMP 檢測方法擴增時間為45 min，與實時熒光RT-PCR 相比，在靈敏度相同的情況下能節(jié)省約35 min 的時間，且在任何一個恒溫儀器上都可操作，十分便利。因此，本研究建立的RT-LAMP 可視化檢測方法特異、靈敏、快速，適用于臨床NAPRRSV 的快速檢測，不僅可為豬場的病原篩查和疫情防控提供技術(shù)支撐，還能為了解病毒變異、預測疫情變化及采取有效防控措施提供參考。