牛結(jié)核病污染場(chǎng)4 種檢測(cè)方法評(píng)估

張建東，陳永林，馬宏偉，劉天駒，張 濤，李 釗，趙建東，米吉提·莫合他爾汗，顏成旭，路廣計(jì)，張喜悅

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000；2.洛陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南洛陽(yáng) 471000；3.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050000；4.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控住中心，河北石家莊 050000；5.濟(jì)源市動(dòng)物疫病控制中心，河南濟(jì)源 459000；6.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830000；7.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

牛結(jié)核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝桿菌屬牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染性疾病，給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。牛分枝桿菌感染宿主廣泛，除可感染人外，還可感染50 多種哺乳動(dòng)物[2]。牛結(jié)核病目前尚無(wú)有效疫苗預(yù)防，藥物治療成本太高，所以“檢測(cè)+撲殺”是控制該疫病的主要手段。

我國(guó)目前的牛結(jié)核病檢測(cè)方法主要包括，結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）、比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（SICTT）、γ-干擾素ELISA試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）、抗體ELISA 試驗(yàn)和膠體金檢測(cè)等[3]。TST 是我國(guó)牛結(jié)核病檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，也是國(guó)際貿(mào)易指定方法。此方法靈敏度高，但特異性差，無(wú)法排除其他結(jié)核桿菌干擾。SICTT 與TST相比，可排除其他桿菌干擾，減少假陽(yáng)性。TST 和SICTT 檢測(cè)成本低，但操作麻煩、耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果判定主觀性強(qiáng)[4]。IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但成本較高[5]?？贵wELISA是現(xiàn)代抗體檢測(cè)的主要方法，但牛分枝桿菌抗原表位復(fù)雜，不同階段可產(chǎn)生不同抗體，因而導(dǎo)致檢測(cè)陽(yáng)性率偏低[6]。

結(jié)核病污染場(chǎng)內(nèi)，牛分枝桿菌普遍存在，需要敏感性更高的檢測(cè)方法，來(lái)盡量避免漏檢，從而加快凈化進(jìn)程。本試驗(yàn)采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)牛結(jié)核病污染場(chǎng)的牛群進(jìn)行檢測(cè)，比較分析不同試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，以期為我國(guó)牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化提供有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 牛PPD、禽PPD、INF-γ 夾心ELISA 檢測(cè)試劑盒（批次P201906-001），均購(gòu)自青島瑞爾公司；牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)190504），購(gòu)自韓國(guó)安世佳合有限責(zé)任公司。儀器包括：剪毛剪、0.5 mL 注射器、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀（包含450 nm 和620～650 nm 濾光片）、CO2培養(yǎng)箱、12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、肝素鈉采血管、移液器及吸頭等。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的300頭泌乳牛。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

1.2.1.1 TST 試驗(yàn) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T 18645—2002）的要求操作和結(jié)果判定：采用牛型PPD，劑量為2 000 IU，分別于注射前和注射后72 h 測(cè)量皮膚厚度，并計(jì)算皮厚差。皮厚差≥4.0 mm，為陽(yáng)性；2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm，為疑似；皮厚差＜2.0 mm，為陰性。疑似牛于第1 次檢疫 60 d 后進(jìn)行復(fù)檢，仍為疑似時(shí)，60 d 后再?gòu)?fù)檢，如仍為疑似，則判為陽(yáng)性。

1.2.1.2 SICTT 試驗(yàn) 采用牛PPD 和禽PPD，在牛頸部左側(cè)分點(diǎn)皮內(nèi)注射，注射點(diǎn)間隔12～15 cm，72 h 后，觀察注射部位的炎性反應(yīng)，并量取皮皺厚，根據(jù)皮皺厚增加值判定。牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差＞4 mm，判為陽(yáng)性；1 mm ＜牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差≤4 mm，判為可疑；牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD 皮厚差，判為陰性。

1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 試驗(yàn) 采集5 mL 血液肝素抗凝血液，各取1.5 mL 加入3 個(gè)孔中，然后分別取100 μL 的牛型PPD、禽型PPD 和陰性對(duì)照磷酸鹽緩沖液（PBS），加入抗凝全血中，混勻后放于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。用移液器小心吸取培養(yǎng)上清，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，即獲得刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清。取出單抗包被板，每孔加入50 μL 樣品稀釋液，然后加入50 μL 待測(cè)樣品或?qū)φ?，混勻后室溫作? h；洗滌，每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，室溫作用1 h；洗滌后每孔加入100 μL 底物，室溫避光作用30 min 后，加入終止液，測(cè)定OD450nm值。當(dāng)牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清OD 值-禽型PPD 刺激上清OD值≥0.1，為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.2.1.4 抗體ELISA 試驗(yàn) 按照牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行，計(jì)算S/P值。S/P=（樣品OD450nm平均值-陰性對(duì)照OD450nm平均值）/（陽(yáng)性對(duì)照OD450nm平均值-陰性對(duì)照OD450nm平均值）。S/P≥0.3 為陽(yáng)性，S/P＜0.3為陰性。

1.2.2 評(píng)估方法 以TST 試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，分別與SICTT、IFN-γ-ELISA、抗體ELISA 檢測(cè)結(jié)果比較，計(jì)算符合率，并運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行對(duì)比，分析敏感性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TST 與IFN-γ-ELISA

對(duì)比結(jié)果（表1）顯示：TST 檢出陽(yáng)性114 份，IFN-γ-ELISA 檢出陽(yáng)性154 份，符合率為72.7%，經(jīng)SPSS 分析，P＜0.05，說(shuō)明IFN-γ-ELISA 陽(yáng)性檢出率顯著高于TST，表明其敏感性明顯高于TST。

表1 TST 與IFN-γ-ELISA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位：份

2.2 TST 與SICTT

對(duì)比結(jié)果（表2）顯示：TST 檢出陽(yáng)性114份，SICTT 檢出陽(yáng)性103 份，符合率為96.3%，經(jīng)SPSS 分析，P＞0.05，說(shuō)明SICTT 陽(yáng)性檢出率略低于TST，但差異不顯著，表明兩種方法的敏感性相似。

表2 TST 與SICTT 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位：份

2.3 TST 與抗體ELISA

對(duì)比結(jié)果（表3）顯示：TST 檢出陽(yáng)性114 份，抗體ELISA 檢出陽(yáng)性21 份，符合率為69.0%，經(jīng)SPSS 分析，P＜0.05，說(shuō)明抗體ELISA 陽(yáng)性檢出率顯著低于TST，表明其敏感性明顯低于TST。

表3 TST 與抗體ELISA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位：份

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)牛結(jié)核病流行率普遍升高，結(jié)核病污染場(chǎng)數(shù)量逐漸增加[7]。本試驗(yàn)利用4 種檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)核病污染場(chǎng)的奶牛進(jìn)行檢測(cè)。以TST為參考標(biāo)準(zhǔn)，分別與其他3 種方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ-ELISA 敏感性最高，明顯大于TST，而其他2 種方法的敏感性都低于TST。在牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化過(guò)程中，要將所有感染牛盡可能全部篩檢出來(lái)，這就需要敏感性高的檢測(cè)方法，因此IFN-γ-ELISA 是首選的檢測(cè)方法。

TST 試驗(yàn)是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，也是國(guó)際貿(mào)易指定方法，但其結(jié)果判定存在人為誤差，尤其是大量檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性漏檢。在牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化初期，需要進(jìn)行大量檢測(cè)，如果采用TST 檢測(cè)，就會(huì)漏檢感染牛，使其繼續(xù)污染牛群[8-9]。SICTT 雖然可排除禽結(jié)核桿菌的干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但其陽(yáng)性檢出率更低，同樣不適合牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化。抗體ELISA 檢測(cè)是現(xiàn)代血清檢測(cè)的主要方法，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少，但因不同感染階段的牛分支桿菌抗體比較復(fù)雜，無(wú)法準(zhǔn)確捕獲[10]，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率也明顯比TST 偏低，因此也不適合用于牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化檢測(cè)。

TST 和SICTT 這兩種方法適合在基層推廣，成本低，但主觀性強(qiáng)，檢測(cè)過(guò)程對(duì)牛的應(yīng)激影響較大[11]?？贵wELISA 檢測(cè)時(shí)間短，出結(jié)果快，但成本較高，陽(yáng)性檢出率偏低[12]。IFN-γ-ELISA 操作復(fù)雜、成本高，檢測(cè)要求較高，不適合在基層推廣，但檢測(cè)敏感性高[13]。因此，在實(shí)際的牛結(jié)核病檢測(cè)中，應(yīng)根據(jù)不同的需要和條件，選擇合適的檢測(cè)方法，也可以不同方法聯(lián)合使用。在條件不允許情況下，可以用TST 對(duì)牛結(jié)核病污染場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。因IFN-γ-ELISA 是4 個(gè)方法中最敏感的方法[14]，所以在條件允許的情況下，在牛結(jié)核病污染場(chǎng)最適合選用，這樣可以盡量避免漏檢感染牛。在牛結(jié)核病污染場(chǎng)，患結(jié)核病的牛數(shù)量較多，如果檢測(cè)方法不敏感，就會(huì)導(dǎo)致大量陽(yáng)性牛漏檢，使牛群凈化困難[15]。如果每年春秋兩季，對(duì)牛場(chǎng)進(jìn)行IFN-γ-ELISA 檢測(cè)，及時(shí)隔離淘汰陽(yáng)性牛，連續(xù)檢測(cè)幾年，牛場(chǎng)就會(huì)達(dá)到凈化目標(biāo)[16]。

4 結(jié)論

評(píng)估認(rèn)為，在TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測(cè)方法中，IFN-γ-ELISA 方法敏感性最高，陽(yáng)性檢出率最高，可以盡可能地將感染牛全部檢出，減少漏檢，因此最適合用于牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化。