羊布魯氏菌疫苗（S2 株）口服免疫試驗(yàn)

薛 萍，宗曼合，鄭永波，楊小虎，楊 程

（1.平?jīng)鍪袆?dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅平?jīng)?744000；2.平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)香蓮鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，甘肅平?jīng)?744000）

布魯氏菌?。╞rucellosis，以下簡(jiǎn)稱布病）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人獸共患變態(tài)反應(yīng)性傳染病[1]。布魯氏菌屬有6 個(gè)種，其中羊種布魯氏菌侵入性最強(qiáng)[2]，主要侵害宿主的生殖系統(tǒng)和關(guān)節(jié)等器官，也是引起人感染的主要菌型。布病全球流行給畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康帶來極大危害[3]，因此我國(guó)將其列為二類動(dòng)物傳染病，并列入《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》重點(diǎn)防控疫病目錄[4]。該病主要經(jīng)消化道、皮膚黏膜和呼吸道等途徑侵入機(jī)體而發(fā)病，引起生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害[5]。

目前，我國(guó)對(duì)布病實(shí)施分區(qū)防控策略?！?009－2015 年布魯氏菌病結(jié)核病防治規(guī)劃大綱》要求，在布病未控制區(qū)（疫區(qū)）實(shí)施以免疫為主的防控措施。目前，我國(guó)使用的布魯氏菌疫苗主要有M5、Rev-1、S19、S2 毒株，均為弱毒疫苗。M5、Rev-1、S19 毒株優(yōu)點(diǎn)是免疫期長(zhǎng)、抗體反應(yīng)強(qiáng)烈，其中M5 有效免疫期長(zhǎng)達(dá)5 年，Rev-1、S19 毒株可達(dá)3 年，但缺點(diǎn)是免疫方式要求較高，須注射或點(diǎn)眼免疫，操作復(fù)雜，不適合大批量同時(shí)免疫，且存在較高的工作人員感染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)孕畜也不安全。而S2 毒株活疫苗口服免疫，簡(jiǎn)單方便，有助于提高免疫密度，雖然抗體反應(yīng)弱，但通過加大免疫劑量或加強(qiáng)免疫，也可提高免疫保護(hù)率[6]。

近年來，甘肅省平?jīng)鍪胁疾∫咔楸容^平穩(wěn)，但偶有反彈勢(shì)頭。為保障人民群眾身體健康和養(yǎng)羊業(yè)持續(xù)發(fā)展，該市決定在全市布病流行較為嚴(yán)重的縣（區(qū)），對(duì)易感羊只采用布氏菌病活疫苗S2 株口服免疫。為充分了解該疫苗整群口服免疫的安全性和免疫效果，在免疫工作全面開展前，選擇了2個(gè)行政村開展了小范圍免疫試驗(yàn)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在平?jīng)鍪腥A亭縣策底鎮(zhèn)、崆峒區(qū)崆峒鎮(zhèn)，各選1 個(gè)行政村，以所選2 個(gè)行政村散養(yǎng)戶飼養(yǎng)的264 只未免疫羊作為試驗(yàn)羊，進(jìn)行布魯氏菌（S2 株）活疫苗口服免疫試驗(yàn)。所有試驗(yàn)羊只在口服免疫試驗(yàn)前，采集血清，用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法進(jìn)行檢測(cè)，全部為陰性。

1.2 疫苗與試劑

試驗(yàn)用布魯氏菌S2 株活疫苗（批號(hào)5393060），購自金宇保靈生物藥品有限公司。布病虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）抗原（批號(hào)201603）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）抗原（批號(hào)201603）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)201608），均購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組與免疫

按照Ding 等[7]介紹的方法進(jìn)行試驗(yàn)分組與口服免疫，用專用投藥槍進(jìn)行灌服。將264 只羊，按月齡不同分為2 組（表1）：3 月齡以上組（包括懷孕母羊），在疫苗使用說明書使用劑量基礎(chǔ)上，加倍劑量灌服免疫，即每只口服活菌100×2 億，用生理鹽水稀釋至4 mL；3 月齡及以下組，按說明書正常劑量免疫，即每只口服活菌100 億，用生理鹽水稀釋至2 mL。

表1 試驗(yàn)羊只分組 單位：只

2.2 臨床觀察與抗體檢測(cè)

對(duì)264 只試驗(yàn)羊口服免疫布魯氏菌活疫苗后進(jìn)行連續(xù)臨床觀察，記錄免疫羊只出現(xiàn)的不良反應(yīng)；分別在免疫30、60、180、210 d 后，采集羊血，分離血清并詳細(xì)編號(hào)登記，同時(shí)采用RBT+SAT垂直檢測(cè)和 ELISA 檢測(cè)方法，進(jìn)行免疫抗體跟蹤檢測(cè)，然后對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。RBT+SAT 垂直檢測(cè)，即先用RBT 初檢，陽性的再用SAT 復(fù)檢，全為陽性的判定為陽性。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床觀察

2 個(gè)試驗(yàn)組，即3 月齡以上（包括懷孕羊只）和3 月齡及以下羊只，采用布魯氏菌S2 株活疫苗口服免疫后，均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

3.2 免疫抗體檢測(cè)

3.2.1 總體情況 檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：布魯氏菌S2 株活疫苗口服免疫30 d 后，試驗(yàn)羊只2 種檢測(cè)方法檢測(cè)的免疫抗體陽性率分別為47.3%和53.8%，隨免疫天數(shù)增加，抗體陽性率不斷遞減，至210 d 時(shí)，免疫抗體陽性率分別降至1.5%和2.3%，免疫抗體幾乎消失。

表2 免疫后不同時(shí)間、不同方法抗體水平檢測(cè)結(jié)果

3.2.2 分組情況 2 組試驗(yàn)羊的檢測(cè)結(jié)果（表3～4）顯示，3 月齡以上羊只不同免疫時(shí)間2 種檢測(cè)方法的免疫抗體陽性率均略高于3 月齡及以下羊只；對(duì)2 種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)差異不顯著（P＞0.05）。

表3 3 月齡以上羊免疫后不同時(shí)間、不同方法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 3 月齡及以下羊免疫后不同時(shí)間、不同方法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

4 討論

布魯氏菌弱毒活疫苗S2 株為光滑型菌株，存在相應(yīng)的缺陷，易誘導(dǎo)產(chǎn)生S-LPS 抗原“O”鏈特異性抗體，免疫后無法鑒別人工免疫群和自然野毒感染群[8-9]，從而干擾常規(guī)診斷結(jié)果，給臨床確診造成一定困難。

本試驗(yàn)免疫30 d 后檢測(cè)到的平均抗體陽性率為47.3%（RBT+SAT）和53.8%（ELISA），與趙詠中等[10]口服正常劑量得到的最高免疫抗體陽性率基本一致。布魯氏菌弱毒疫苗S2 株抗體反應(yīng)較弱，因而需加強(qiáng)免疫?？紤]到羊群弱毒疫苗免疫會(huì)產(chǎn)生免疫人員感染風(fēng)險(xiǎn)，且補(bǔ)免不僅會(huì)加大工作量，也會(huì)加大感染風(fēng)險(xiǎn)，為確保免疫效果，本試驗(yàn)對(duì)3月齡以上羊只在常規(guī)免疫劑量基礎(chǔ)上加倍免疫，同時(shí)為保證免疫羊群的安全性，對(duì)3 月齡及以下羊只采用常規(guī)劑量免疫。試驗(yàn)結(jié)果表明，2 組試驗(yàn)羊只均產(chǎn)生了理想的抗體陽性率，且均未發(fā)生不良反應(yīng)，加倍劑量試驗(yàn)組免疫抗體略高于常規(guī)劑量免疫組，證明該疫苗試驗(yàn)劑量對(duì)所有月齡羊只包括懷孕羊都是安全有效的。這與樊生平等[11]和申捷等[12]的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)因所在單位無妊娠診斷設(shè)備，所以在試驗(yàn)分組時(shí)未統(tǒng)計(jì)懷孕羊只數(shù)量，但可以確定試驗(yàn)羊只中存在一定數(shù)量的懷孕母羊，所以說布魯氏菌S2 株弱毒苗加倍劑量口服免疫，對(duì)懷孕羊只也是安全的。總之，在試驗(yàn)劑量下，用布魯氏菌活疫苗S2 株口服免疫1 次，即可產(chǎn)生理想的免疫效果，從而降低了免疫工作量和人員感染風(fēng)險(xiǎn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫180 d 后仍有5.7%和7.2的羊只為抗體陽性，免疫210 d 后仍有1.5%和2.5%為抗體陽性，而此時(shí)的抗體陽性是感染陽性還是免疫陽性，需進(jìn)一步探討。

RBT 敏感性較高，但特異性低，易受試驗(yàn)溫度、凝集時(shí)間和檢測(cè)人員主觀因素的影響，只能作為初篩；SAT 是國(guó)標(biāo)確診方法，但該方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，其判定也受主觀因素影響。OIE 規(guī)定ELISA 為布病的國(guó)際貿(mào)易確診方法。該方法敏感性和特異性均好，檢測(cè)時(shí)間比試管凝集更短，適于大批量檢測(cè)，由于操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，因而減少了人為因素干擾，易標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制[13]。但相比前兩種方法，ELISA 檢測(cè)成本較高。這幾種檢測(cè)方法都有各自的局限性，其敏感性和特異性會(huì)因樣本量的不同而有所差異[14-16]。

本試驗(yàn)只是小范圍的免疫試驗(yàn)，而免疫效果和安全性受多種因素影響，因此需要開展S2 疫苗口服免疫的大規(guī)模田間試驗(yàn)。不同地區(qū)可根據(jù)本地實(shí)際，先進(jìn)行小范圍試點(diǎn)，然后逐步推廣使用。

5 結(jié)論

試驗(yàn)表明：布魯氏菌S2 株活疫苗正常劑量免疫3 月齡及以下羊只、加倍劑量免疫3 月齡以上羊只（包括懷孕母羊）均安全有效，一次免疫即可產(chǎn)生理想的免疫保護(hù)效果，可先行試點(diǎn)，逐步推廣應(yīng)用。