電針井穴結(jié)合顳三針對(duì)急性腦缺血大鼠NSE的影響

深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院針灸科, 廣東 深圳 518133

急性腦缺血(Acute Cerebral Infarction，ACI)疾病是常見的腦血管病，本病常見發(fā)病急聚、病情較重、變化多樣、復(fù)發(fā)率高、致殘率高及致死率高的特點(diǎn)。在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中針灸學(xué)占有重要地位，用于疾病的預(yù)防和治療，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有可能躋身于國(guó)際科學(xué)前沿的重要領(lǐng)域。因此，研究針灸學(xué)防病治病的作用機(jī)理，對(duì)推動(dòng)針灸在臨床的推廣運(yùn)用有著非常至關(guān)重要的作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)， 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase， NSE)的水平對(duì)腦梗死的病灶大小以及預(yù)后具有著重要的臨床意義[1]， 可用來作為腦梗死的敏感性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[2]。而關(guān)于電針井穴結(jié)合顳三針對(duì)ACI大鼠對(duì)血清中NSE水平的影響在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。 本研究觀察運(yùn)用電針中沖(雙)、涌泉(雙)結(jié)合針刺顳三針對(duì) ACI大鼠神經(jīng)功能缺損的治療效果及血清中 NSE水平的變化，旨在為臨床運(yùn)用井穴結(jié)合顳三針治療急性缺血性卒中提供些許理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 篩選清潔級(jí)成年Wistar雄性8月齡大鼠48只，體質(zhì)量(400±50)g，光照下喂養(yǎng)12h、室溫控制在23～25℃左右、讓其處于在自由飲食的環(huán)境中生存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 尼莫地平(30 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)， NSE酶聯(lián)免疫試劑盒(上海臻科生物科技有限公司)， 酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) BD公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 篩選清潔級(jí)成年Wistar雄性8月齡大鼠48只，從中隨機(jī)選取32只大鼠，采用電凝阻斷大腦中動(dòng)脈的方法建立 ACI模型大鼠， 余下16只用于假手術(shù)模型建造，建模后的16只假手術(shù)模型大鼠隨機(jī)分成2組，每組各8只，建模后的32只大鼠ACI模型大鼠隨機(jī)分成4組，每組各8只；建模后24 h從假手術(shù)模型和ACI模型大鼠中各隨機(jī)選取一組進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，剩余的一組假手術(shù)模型大鼠作為假手術(shù)組，將剩下的3組ACI模型大鼠分別命名為針刺治療組、空白模型組和西藥對(duì)照組。

采用電凝法阻斷大腦中動(dòng)脈(Middle Cerebral Artery，MCA) 制作大鼠腦卒中模型[3]：即首先對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，使用3.5%水合氯醛，劑量為1 mL/100 g，麻醉后，取大鼠俯臥位并將大鼠頭部固定，以頭頂正中線為基線，向左側(cè)旁開0.3 cm處，做與正中線平行切口，長(zhǎng)約1 cm左右，分離皮膚將顳肌從顱骨上剝離，暴露顳窩，使用顱骨鉆在鱗狀骨前部打孔，使用小咬骨鉗向前下方擴(kuò)大骨窗(注意不破壞硬腦膜)。在大約左眼和右耳之間的連線上的大腦皮層表面，可看MCA。使用玻璃分針使MCA 充分暴露。使用電熱燒灼器( 932 型，上海醫(yī)療器械股份有限公司) ，調(diào)好適宜熱度，在嗅束和MCA交界區(qū)對(duì)其進(jìn)行凝斷，術(shù)后縫合并進(jìn)行保溫和感染預(yù)防。假手術(shù)組不凝斷MCA，其余過程同前。 術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)、觀察。

1.2.3 干預(yù)方法 針刺治療組選取中沖、涌泉、顳三針(穴位定位均參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4])。采用一次性無菌毫針(0.25mm×25mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)，刺入2～4mm深，選取井穴接華佗牌 SDZ-V 型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)，左右側(cè)肢體井穴分別各接一對(duì)，采用刺激的電流為1～2 mA，頻率2 Hz/20 Hz，疏密波，每次刺激30 min，1次/d，共治療7 d。西藥治療組腹腔注射尼莫地平(德國(guó)BAYER 20mg)灌胃，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”確定灌胃使用的藥物用量，根據(jù)尼莫地平12 mg/Kg的使用劑量，使用生理鹽水按0.6 mg/mL的比例配制藥物，每天2次(分別于早、晚灌胃)，治療7 d為1個(gè)療程?？瞻啄Ｐ徒M與假手術(shù)組均做常規(guī)飼養(yǎng)不做任何干預(yù)處理。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)方法 各組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭取血，制備血漿，置4℃ 冰箱，待血液凝固后采用5 000 r/min 離心10 min，取出血清。按照NSE ELISA 試劑盒說明測(cè)定血清 NSE水平。

1.2.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)方法 在造模結(jié)束后24h和治療7d后，分別采用 Longa[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為五個(gè)等級(jí)：0 分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1 分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)；3 分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分范圍在 ≥1 且 <4分者判定為為模型建造成功，不符合評(píng)分要求的予以剔除。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)缺損功能評(píng)分比較 造模后24h，對(duì)比針刺治療組、西藥對(duì)照組與空白模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，三組分別與假手術(shù)組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療7 d后，對(duì)比針刺治療組與西藥對(duì)照組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而兩組分別與空白模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的神經(jīng)缺損功能評(píng)分比較 (分，

注：造模后24h與假模型組比較，★P<0.01；治療7d后，與空白模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠的血清NSE比較 造模后24h，對(duì)比模型組和假手術(shù)組 NSE水平，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療7 d后，對(duì)比針刺治療組與西藥對(duì)照組大鼠的NSE水平，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而兩組分別與空白模型組大鼠NSE水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別n24h7d假手術(shù)組84.68±1.745.13±2.12空白模型組8 15.23±3.51*12.31±3.34*西藥對(duì)照組8 15.23±3.51*8.75±2.37*#針刺治療組8 15.23±3.51*9.54±2.64*#

注：造模后24h，與假手術(shù)組比較，*P<0.05；治療7d后，與假手術(shù)組比較，*P<0.05，與空白模型組比較，#P<0.05。

3 討論

2015年我國(guó)卒中協(xié)會(huì)首次發(fā)布中國(guó)卒中流行報(bào)告[6]顯示每21秒就會(huì)有1人因卒中而死亡，在我國(guó)卒中已成為危害生命健康的首位疾病。急性腦缺血，即缺血性卒中的急性發(fā)作，是臨床常見的腦血管疾病，中醫(yī)稱之為“中風(fēng)”。中醫(yī)認(rèn)為情志過極、飲食不節(jié)、內(nèi)傷耗損、體態(tài)肥盛等，引動(dòng)內(nèi)風(fēng)旋動(dòng)，氣血逆亂，上犯腦絡(luò)，致使血瘀腦脈或血溢于脈外，因而發(fā)為中風(fēng)[7]。

近十年來國(guó)內(nèi)臨床運(yùn)用針灸治療相關(guān)疾病的研究表明，急性缺血性卒中在臨床上應(yīng)用針灸治療已被證實(shí)是一種安全可靠有效的方法，可以有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀[8]。 臨床研究表明[9-11]井穴刺絡(luò)療法可有效改善中風(fēng)患者急性期意識(shí)障礙、運(yùn)動(dòng)功能和日常生活活動(dòng)能力的恢復(fù)。且多項(xiàng)臨床研究[12-14]表明，井穴刺絡(luò)能夠調(diào)節(jié)顱內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)，刺激外周血管壁交感神經(jīng)，增強(qiáng)損傷腦組織的能量供應(yīng)，平衡缺血區(qū)細(xì)胞外離子濃度，調(diào)節(jié)缺血區(qū)域氧分壓，改善血腦屏障通透性等。王澍欣等[15]研究發(fā)現(xiàn)針刺顳三針對(duì)腦部代謝和神經(jīng)的興奮性有顯著功效，具有促進(jìn)急性缺血性中風(fēng)患者神經(jīng)功能缺損恢復(fù)的作用[16]，從而提高患者的生存質(zhì)量。

臨床上應(yīng)用井穴配合顳三針治療中風(fēng)也取得的很好的療效[17]。此療法方法獨(dú)特、可操作性好，其中井穴位于四肢末稍是表里陰陽經(jīng)交接之處， 經(jīng)氣“發(fā)生”之所在，井穴針刺適用于 “氣血逆亂，上犯腦絡(luò)” 的病機(jī)。針刺井穴具有激發(fā)臟腑經(jīng)氣之運(yùn)行、經(jīng)絡(luò)之疏通、陰陽之調(diào)整及醒腦醒神等效用。顳三針位于頭部顳側(cè)，研究[18]表明針顳部穴位可激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣血運(yùn)行、促進(jìn)局部血流運(yùn)行之功效，可促使側(cè)枝循環(huán)的建立，重建功能活動(dòng)的神經(jīng)通路。

在神經(jīng)細(xì)胞中，NSE是參與糖酵解的關(guān)鍵酶，是能夠非常敏感的反映神經(jīng)元損傷的一項(xiàng)生化指標(biāo)。 MOORE等[19]1965年首次提出一種酸性的可溶性蛋白14-3-2，隨后發(fā)現(xiàn)這種蛋白特異性定位于神經(jīng)元細(xì)胞中并且具有酶的活性，故稱之為 NSE[20]。由于烯醇化酶主要由α、β、γ以三種不同的亞基以二聚體的形式存在，目前已發(fā)現(xiàn)的是 αα、ββ、γγ、αβ、αγ等5種烯醇化酶同工酶，其中特異性地存在于神經(jīng)元及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的是αγ和γγ兩型，故稱為神經(jīng)元特異性烯醇化酶。在正常的健康人的腦脊液和外周血中的 NSE含量通常是含有非常低的含量，當(dāng)急性腦組織損傷時(shí)，神經(jīng)元變性、壞死，神經(jīng)元細(xì)胞膜及血腦屏障遭到損傷破壞，其通透性增加，從而導(dǎo)致NSE被大量釋放到血液中。 研究證實(shí)NSE在外周血中的存在與神經(jīng)細(xì)胞的高死亡率相關(guān)[21]。 血清 NSE水平隨 ACI患者病灶直徑及神經(jīng)損傷程度的加重而升高[22][23]，且神經(jīng)功能的改善與 NSE水平降低明顯相關(guān)[24]， NSE含量變化可以反映腦損傷的嚴(yán)重程度，其作為預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療指標(biāo)具有重要的臨床意義[25]。因此， NSE是用于評(píng)估神經(jīng)元損傷的重要生物學(xué)指標(biāo)[26]，可作為改善缺血性卒中的病情診斷和治療后評(píng)估的敏感性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[27]。

綜上所述，電針井穴結(jié)合顳三針可有效改善 ACI大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀， 其機(jī)理可能與血清 NSE水平降低相關(guān)。臨床上多應(yīng)用井配合顳三針對(duì)卒中認(rèn)知障礙相關(guān)研究，但對(duì)急性缺血性卒中的療效及機(jī)理研究鮮有報(bào)道，本次研究旨在為臨床運(yùn)用井穴結(jié)合顳三針治療急性缺血性卒中提供些許理論依據(jù)。但缺乏臨床證據(jù)，臨床試驗(yàn)將是課題組今后的研究重點(diǎn)。