夏枯草提取物的藥理作用和研究進展

向潤清1 張艷嬌1 黃 寬1 林艾和1 陳 玉1 高雪娟1 張 芳1 范 源2

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500

夏枯草為唇形科(Lamiaceae)植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一種藥食同源的多年生草本植物，至今已有幾千年的藥用歷史。夏枯草味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，可清肝散火、明目、散結(jié)消腫[1]，對目赤腫痛、畏光流淚、目珠夜痛、頭暈?zāi)垦?、瘰疬、癭瘤、乳腺癌、高血壓、淋巴結(jié)核、浸潤性肺結(jié)核、單純性甲狀腺腫、腮腺炎、急性黃疸型傳染性肝炎等多種疾病均有良好的臨床治療效果[2-5]?，F(xiàn)代研究表明，夏枯草提取物，包括水提取物、醇提取物、乙酸乙酯萃取部位具有抗腫瘤、抗菌消炎、免疫抑制、清除自由基及抗氧化、抑制病毒生長等多種藥理作用[6-8]，隨著對夏枯草及其提取物研究的逐漸深入，其相關(guān)的藥理作用也逐漸明確，且臨床研究也越來越廣泛。筆者對近10 年夏枯草提取物藥理作用的研究進行綜述，為其進一步的開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 抗腫瘤作用

1.1 肝癌 姜瓊等[9]研究表明，夏枯草水提取物可明顯抑制肝腫瘤細胞株HepG2的生長，并呈濃度和時間依賴性。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)法檢測夏枯草水提取作用HepG2 細胞0、0.75、1.5、3、6、12、24 h后抗凋亡因子B 細胞淋巴瘤2(Bcl-2)和促凋亡因子Bax mRNA 的表達情況，結(jié)果顯示，夏枯草水提取物 能夠抑制HepG2 細胞中Bcl-2 mRNA 的表達，促進Bax mRNA 的表達，且在24h 內(nèi)，隨著時間的延長，具有一定的時間依賴關(guān)系。張星星等[10]實驗顯示，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度的夏枯草水提取物 對HepG2 增殖抑制作用，結(jié)果顯示夏枯草水提取物對HepG2 細胞有較強的抑制增殖作用，并呈一定的濃度依賴性，體外實驗顯示夏枯草水提取物 能抑制小鼠移植性肝癌H22 實體瘤，當夏枯草水提取物 作用濃度為2.5 g/mL 和1.25 g/mL時，其抑瘤率分別是37.84% 、34.82%。Hwang 等[11]在研究中夏枯草水提取物 以10、50 和100 μg/mL的終濃度作用HepG2 細胞24 h，其抑制率分別是28%、61%、93%，用濃度10 μg/mL誘導(dǎo)HepG2 細胞24 h后，可上調(diào)Bax、促細胞凋亡因子Fas 和磷酸化腫瘤抑制因子p53 mRNA 的表達，下調(diào)Bcl-2 mRNA 的表達，即夏枯草水提取物可抑制HepG2 細胞的活力與增殖，誘導(dǎo)其凋亡。Li 等[12]研究表明，夏枯草提取物濃度分為125,250,500 μg/mL作用HepG2 細胞24 h，MTT 檢測其抑制率，結(jié)果顯示夏枯草提取物有較強的抑制增殖作用，并呈一定的濃度依賴性，當其濃度500 μg/ mL作用HepG2 細胞48 h時，細胞染色質(zhì)濃縮和周期阻滯在G0/G1 期，并上調(diào)促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)的表達，促使活性氧(ROS)的過量生產(chǎn)和線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細胞凋亡。Su 等[13]研究表明夏枯草提取物可抑制12-O-四氫呋喃酚13-乙酸鹽(TPA)誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)活化并抑制肝癌細胞系(Huh-7和HA22T)細胞侵襲和遷移。夏枯草提取物通過抑制激活蛋白(AP)-1 和核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)活性來抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和MMP-9 轉(zhuǎn)錄，并通過抑制細胞外信號相關(guān)激酶(ERK)的磷酸化，下調(diào)p38 信號通路抑制TPA誘導(dǎo)的NF-抑制作用來抑制TPA 誘導(dǎo)的AP-1 活性，即夏枯草提取物可通過抑制多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來修飾肝細胞癌(HCC)的轉(zhuǎn)移性微環(huán)境。Kim 等[14]實驗結(jié)果顯示夏枯草水提取物通過抑制金屬蛋白酶MMP-2 和MMP-9 的活性而不影響細胞活力來影響人肝癌細胞的遷移和侵襲。用10 mg/mL夏枯草水提取液作用HepG2、Huh-7 和Hep3B 24 h時，抑制了近60%的Huh-7 和Hep3B 細胞遷移，而處理48 h 后，抑制了70%以上的HepG2 遷移，用0、5 和10 mg/mL 夏枯草水提取液處理細胞48 h，RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)HepG2 細胞中MMP-2、MMP-9mRNA 的表達下調(diào)，導(dǎo)致體外抑制細胞遷移和侵襲的酶活性發(fā)生改變，抑制腫瘤細胞增殖。

1.2 肺癌 王攀等[15]研究表明，將處理好的夏枯草提取物300 μg/mL 作用人肺腺癌A549細胞，用雙向電泳技術(shù)分離，掃描得到蛋白質(zhì)組圖譜，篩選差異在2 倍以上的蛋白質(zhì)作為差異蛋白進行質(zhì)譜鑒定，用Western 印跡方法進行初步驗證，結(jié)果顯示經(jīng)夏枯草提取物處理后，A549 細胞中1,4,5-三磷酸肌醇受體相互作用樣前體蛋白、熱休克同源蛋白70、絲氨酸-蘇氨酸激酶相關(guān)受體蛋白、1 型原肌球蛋白2(β)、細胞周期蛋白B3、MED12L 蛋白和微絲交聯(lián)蛋白亞型2 表達量增加，而烯醇酶1、M2 型丙酮酸激酶、熱休克蛋白27、Rho 家族GDP 分離抑制劑1、熱休克蛋白β1、TapasinERP57 異源二聚體A 鏈、無機焦磷酸酶、線粒體半胱氨酰-tRNA 合成酶2 表達量降低，即夏枯草提取物具有多靶點、多途徑地發(fā)揮抗肺腺癌作用。Feng 等[16]實驗顯示夏枯草提取物可抑制A549 細胞和小鼠肺腺癌Lewis細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，用濃度分別為50、100、200、400 μg/ mL的夏枯草提取物作用A549 細胞和Lewis 細胞48 h，計算抑制濃度IC50，發(fā)現(xiàn)夏枯草提取物對兩種細胞均有較強的抑制增殖作用，并呈一定的濃度依賴性。結(jié)果還顯示夏枯草提取物能夠抑制體外Lewis 細胞的增殖，將裸鼠接種Lewis 細胞后，給予濃度為10 mg/kg和5 mg/kg的夏枯草提取物，隨著夏枯草提取物濃度的增加，其控瘤率隨之增加，裸鼠血清中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達也增加。Zhu等[17]實驗顯示不同濃度的夏枯草都對A549 細胞的增殖具有抑制作用，其抑制率表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關(guān)系，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測caspase-3 蛋白表達水平，結(jié)果表明夏枯草提取物可通過激活促凋亡因子caspase-3 的表達并誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制了細胞的生長。夏枯草乙醇提取物(CTW)可抑制非小細胞肺癌SPC-A-1細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。用濃度分別為16、80、400 和2000 μg/mL的CTW 作用SPC-A-1 細胞48 h，其抑制率分別為(20.1±1.98)%，(32.3±5.48)%，(49.8±13.4)%，(97.5±5.95)%，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，此外，CTW 可將SPC-A-1 細胞阻滯于G0/G1期，且隨著CTW 濃度的增加，細胞凋亡率也相應(yīng)增加[18]。

1.3 人結(jié)腸癌 Lin 等[19-20]的研究結(jié)果表明，CTW 可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29 細胞凋亡，抑制其細胞增殖和裸鼠移植瘤血管生成。MTT 檢測CTW 濃度分別為0.5、1、2 mg/L作用HT-29 細胞24 h的存活率，其存活率隨著濃度的增加而降低，并呈濃度依賴性，CTW 作用BALB/c 裸鼠異種移植模型后可顯著抑制腫瘤體積且對裸鼠的體重變化沒有影響，表明CTW 可在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌生長而沒有明顯的毒性跡象，此外，CTW 作用裸鼠異種移植模型后，裸鼠腫瘤內(nèi)的微血管密度(MVD)總數(shù)減少，且抑制了關(guān)鍵的血管生成因子如內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)和內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的表達，最后抑制結(jié)腸癌血管生成。通過RT-PCR 和蛋白印跡法檢測Bcl-2、Bax、自身調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、VEGF-A的mRNA 和蛋白表達，結(jié)果顯示CTW 上調(diào)了Bax/Bcl-2 的比值，下調(diào)了CyclinD1 以及VEGF-A 的表達，最后，這些分子效應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞增殖和腫瘤血管生成。CTW 對人結(jié)腸癌HCT-8 細胞和多藥耐藥細胞株HCT-8/5-FU 具有效的抑制細胞活力作用，且CTW 聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)用藥時，能增強HCT-8/5-FU 對5-FU 的敏感性，逆轉(zhuǎn)細胞株對5-FU 的耐藥性，其可能機制是CTW抑制DNA 拓撲異構(gòu)酶2-α(TOP2α)的表達水平[21-22]。

1.4 甲狀腺癌和乳腺癌

1.4.1 甲狀腺癌 用不同濃度的夏枯草提取物作用甲狀腺癌B-CPAP 細胞72 h后，用MTT 法檢測B-CPAP 細胞的細胞活性，夏枯草提取物顯著抑制B-CPAP，其IC50 為1.53 mg/mL，采用流式細胞術(shù)，TUNEL 和透射電鏡觀察了IC50 濃度的夏枯草提取物處理B-CPAP 細胞48 h后細胞凋亡率，結(jié)果顯示凋亡指數(shù)(AI)和細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，B-CPAP 細胞內(nèi)線粒體腫脹，大小不均一，并且自噬體的數(shù)量增加。免疫組化染色(IHC)檢測夏枯草提取物處理B-CPAP 細胞后bcl-2 蛋白表達的差異，結(jié)果觀察到用夏枯草提取物處理后的bcl-2 蛋白的表達水平低于陰性對照組，即夏枯草提取物處可以顯著促進B-APAP 細胞的凋亡，其促凋亡作用可能與抑制bcl-2 蛋白表達有關(guān)[23]。熊燚等[24]研究夏枯草提取物對不同病理類型的人甲狀腺癌細胞增殖的影響，采用MTT 法測定2.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00、200.00 mg/mL夏枯草提取物對人正常甲狀腺濾泡上皮細胞(HUM-CELL 0097)、人甲狀腺乳頭狀癌細胞(K1)、人甲狀腺髓樣癌細胞(TT)作用24 h，5.42、10.84、21.75、43.44、86.88、173.75 mg/mL夏枯草提取物對人甲狀腺濾泡狀癌細胞(FTC-133)作用24 h，以及1.56、3.13、6.25、12.00、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/mL夏枯草提取物對人甲狀腺鱗癌細胞(SW579)作用24 h增殖的影響，結(jié)果顯示夏枯草提取物作用24 h對HUM-CELL 0097 細胞、K1 細胞、TT 細胞、FTC-133 細胞、SW579 細胞的半數(shù)抑制濃度分別為12.91、2.43、3.44、6.95、31.15 mg/mL。最高抑制濃度為分別為20.00、80.00、40.00、86.88、100.00 mg/mL，即夏枯草對不同病理類型的人甲狀腺癌細胞均有不同程度的抑制增殖作用，且K1 細胞對夏枯草提取物作用最敏感。

1.4.2 乳腺癌 Wei 等[25]的研究中，用不同濃度夏枯草提取物作用MCF-5 乳腺癌細胞48h，MTT 結(jié)果顯示夏枯草提取物顯著抑制了MCF-5 細胞的生長，并且IC 50 值為25 μg/mL，通過流式細胞儀和蛋白質(zhì)印跡法進行細胞周期和蛋白質(zhì)表達分析，結(jié)果顯示夏枯草提取物可增強MCF-5 細胞中Bax 的表達并降低Bcl-2 的表達且將細胞停滯在細胞周期的G2/M 期，從而抗血管生成。

2 免疫調(diào)節(jié)作用

Rui 等[26]研究夏枯草提取物對小鼠免疫功能的影響。實驗將小鼠隨機分為1個對照組和3個治療組，每組10 只，對照組接受純凈水，治療組分別接受濃度為0.15、0.30 和0.90 g/kg的夏枯草提取物30 d，通過熒光激活細胞分選(FACS)、ELISA 法確定活性淋巴細胞和T 淋巴細胞亞群和測量血清中細胞因子的濃度，結(jié)果顯示，對于非特異性免疫，在尋常性假單胞菌治療的小鼠中，NK 細胞活性以劑量依賴性方式顯著增加，在中等劑量和高劑量尋常性假單胞菌治療的小鼠中，單核巨噬細胞功能顯著提高，對于體液免疫，在溶血值(HC50)，溶血斑數(shù)量和血清IgG 水平方面沒有觀察到顯著差異，高劑量組小鼠外周血活動性T和Th 淋巴細胞百分比顯著增高，且4組小鼠之間的血清因子白細胞介素IL-1β，IL-4，IL-10 和γ-干擾素(IFN-γ)水平無顯著差異。即濃度為0.90 g/kg的夏枯草提取物對小鼠的細胞免疫功能和非特異性免疫功能有一定影響。夏枯草提取物對耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-MTB)感染小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。將小鼠隨機用MDR-MTB 菌液尾靜脈注射，建立小鼠MDR-MTB 感染病理模型，夏枯草提取物灌胃后，用ELISA 法檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-10 和IL-12 含量的變化，用RT-PCR 法檢測單個核細胞中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12 及顆粒裂解肽(granulysin，GLS)的mRNA 變化。結(jié)果顯示夏枯草提取物給藥組小鼠血清中IFN-γ、IL-12 含量明顯升高，IL-10 含量明顯下降，在mRNA 表達水平上，夏枯草提取物給藥組IFN-γ、IL-12 和GLS 表達明顯升高，IL-10 mRNA 表達明顯下降，IL-4 變化不明顯。即夏枯草提取物可通過上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄水平增強小鼠的細胞免疫功能[27-28]。

3 抗炎、抗氧化

3.1 抗炎 有研究表明，夏枯草提取物不僅可以抑制前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，而且可以減少脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7 小鼠巨噬細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的分泌，此外，夏枯草提取物通過抑制NF-κB 活性的轉(zhuǎn)錄因子，抑制了LPS 刺激的RAW264.7 細胞中炎癥相關(guān)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和人環(huán)氧化酶2(COX-2)基因表達,從而達到抗炎作用[32-33]。Jun 等[34]的研究報告表明夏枯草乙醇提取物含量為70%時對RAW264.7 細胞具有明顯的消炎作用，其機制可能是通過PI3K/Nrf2 途徑誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1 蛋白的表達，同時減少LPS激活的巨噬細胞和CPL 誘導(dǎo)的敗血癥小鼠血清中HMGB1 的釋放。此外，夏枯草提取物可通過誘導(dǎo)PI3K/AKt 介導(dǎo)的Nrf2 活性，誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1 和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達來抑制ROS/NF-κB 途徑，從而抑制高血糖誘導(dǎo)的血管炎癥[35]。

3.2 抗氧化 有研究顯示夏枯草提取物可以顯著降低高糖飲食的遺傳性高甘油三酸酯小鼠血液中的巴比妥和共軛二烯含量，增加血液GPX 活性和肝臟GSH 含量，并減少UVB 照射的細胞中ROS 的產(chǎn)生，從而減少DNA 損傷[36]。Feng等[37]分別使用ABTS，F(xiàn)RAP 和DPPH 模型評估了不同濃度(95%，60%，30%和0%)的夏枯草乙醇提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，60%的乙醇提取物具有最強的抗氧化作用，總酚含量與抗氧化活性高度相關(guān)(ABTS+中的R2=0.9988，DPPH 中的R2=0.6284，F(xiàn)RAP 測試中的R2=0.9673)。

4 抗菌、抗病毒

4.1 抗菌 Komal 等[29]研究表明，夏枯草提取物可抑制尿路感染患者多藥耐藥大腸埃希菌的抗菌活性，用夏枯草乙醇提取物和水提取物作用44 名患者尿液樣本中的38 種耐藥菌株，結(jié)果顯示夏枯草提取物對大腸桿菌菌株顯示出抗菌活性。黃波等[30]研究夏枯草提取物對5 株臨床耐藥菌株的抗菌活性，采用藥敏試驗(K-B)法及2 倍稀釋法測定夏枯草提取物對耐藥性金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌五株臨床耐藥株的體外抗菌活性，顯示夏枯草提取物對耐藥性痢疾桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌有一定的抑菌作用。管敏等[31]比較了夏枯草不同溶劑提取液的抑菌效果，并對其發(fā)揮作用的機制進行研究。采用牛津杯法和改良二倍稀釋法測定夏枯草提取液的抑菌活性，通過考察金黃色葡萄球菌的生長曲線、細胞形態(tài)、細胞壁和細胞膜的完整性的變化探究白毛夏枯草的抑菌機制。結(jié)果顯示水提液的抑菌作用最強，能顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長，最小抑菌濃度MIC 為15.63 mg/mL，給藥后細菌內(nèi)堿性磷酸酶和蛋白質(zhì)大分子外瀉，細菌形態(tài)改變，即夏枯草提取液對金黃色葡萄球菌有抑制作用，并通過破壞細胞壁和細胞膜的完整性發(fā)揮作用。

4.2 抗病毒 Oh 等[38]的研究表明夏枯草提取物具有抗慢病毒活性，且其抗HIV 作用主要發(fā)生在早期干擾和晚期病毒結(jié)合事件期間，實驗測試夏枯草水提取物和醇提取物抑制HIV-1 感染的能力，結(jié)果顯示水提取物比乙醇提取物具有更高的抗病毒活性，在亞μg/mL的濃度下顯示出對HIV-1 的有效抗病毒活性，而在高于100 倍的濃度下幾乎沒有細胞毒性，其抑制作用是通過干擾病毒粒子后早期結(jié)合而發(fā)生的。有研究表明，夏枯草提取物以劑量依賴的方式抑制HSV-1 噬菌斑的形成，其IC 50 為18 g/mL，噬斑減少試驗表明，夏枯草提取物在100 μg/mL的濃度下對HSV-1 和HSV-2(包括抗阿昔洛韋的菌株)具有明顯的抑制活性[39]。

5 小結(jié)

夏枯草中主要含有萜類、酚酸類、黃酮類、甾醇類、香豆素類、有機酸類、揮發(fā)油類及糖類等成分，因其豐富的化學(xué)成分、顯著的藥理作用和廣泛的臨床應(yīng)用而受到越來越多的關(guān)注。目前，夏枯草提取物主要為水提取物、醇提取物、乙酸乙酯提取物，近年來隨著高效、高靈敏度技術(shù)及生物檢測手段的不斷發(fā)展與應(yīng)用，夏枯草提取物越來越多的藥理作用被發(fā)現(xiàn)，如抗癌、調(diào)節(jié)免疫，抗病毒等。然而，由于提取溶劑的不同，夏枯草不同提取物的有效成分也不一致，其相應(yīng)的藥理作用可能與之有關(guān)系。

夏枯草中萜類成分主要是五環(huán)三萜類，包括齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型，其代表化合物分別是齊墩果酸、熊果酸及白樺酯酸，萜類化合物多具親脂性，難溶于水或不溶于水；揮發(fā)油類主成分為月桂烯、芳樟醇，難溶于水，在低濃度乙醇中只能溶解一部分，易溶于乙醚、乙酸乙酯等有機試劑；糖類成分木糖、甘露糖、鼠李糖，易溶于水，不溶于親脂性有機溶劑，黃酮類成分山柰酚、槲皮素、蘆丁、易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑，難溶于水，香豆素類、甾醇類成分5α,8α-過氧麥角-6,22-二烯-3β-醇、豆甾-7-烯-3β-醇，易溶于易溶于乙醚、乙酸乙酯等有機試劑，酚酸類迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸、有機酸類易溶于水，難溶于有機溶劑；當夏枯草用水、醇、乙酸乙酯3種溶劑提取時，其水提取物溶解的大多為水溶性成分，如酚酸類、糖類和有機酸類，而醇提取物和乙酸乙酯提取物溶解的多為萜類、揮發(fā)油、黃酮、甾醇類、香豆素類，如主要成分熊果酸、齊墩果酸等。雖然提取物所含化學(xué)成分不一致，但其藥理作用有交叉。

由于提取物成分復(fù)雜且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機制等方面研究不夠深入，也不夠具體。因此，有必要對夏枯草提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制進行全面深入研究，為其進一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)