基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的作用機制

孔 麗1，2 左華江2 吳春鳳1

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006

慢性膽囊炎是一種膽囊慢性炎癥病變[1]，屬于慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)右上腹疼痛或不適、 腹脹、噯氣、厭油膩[2-3]。女性患病率高于男性[3]，且中老年群體為高發(fā)群體[1]。慢性膽囊炎屬中醫(yī)“膽脹”范疇，以右脅脹痛為主，針對該病的治療，近年來采用中醫(yī)治療，取得了較好的療效。

薄荷作為唇形科薄荷屬植物[4]，具有抗病毒、興奮中樞、抗菌[5]、保肝利膽、抑菌、抗氧化、抗炎[6]等藥理作用，在《藥性論》等多部古代醫(yī)藥典籍中，薄荷均被記載具有發(fā)汗解表作用，可用于溫病的治療。薄荷的主要成分包括揮發(fā)油、黃酮類等。揮發(fā)油中主要成分為左旋薄荷醇，其含量高達62%～87%[4，7，8]，左旋薄荷酮等。研究表明，薄荷醇和薄荷酮有明顯的利膽作用，其中薄荷醇在膽道的主要代謝產(chǎn)物中起了利膽的作用[4-5]。薄荷中的黃酮類成分中最主要的成分為蒙花苷，具有良好的抗菌作用[7]。雖然薄荷中的揮發(fā)油成分據(jù)報道已有治療慢性膽囊炎的作用[5]，但其活性成分及其相關(guān)作用機制尚不清楚。因此，研究薄荷中活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，為進一步揭示薄荷治療慢性膽囊炎具有重要意義。

傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究大多是基于“單因素觀察”，即證明藥物的某一方面的作用，需要通過對照試驗、施加單一因素作用，以揭示藥物對于疾病的作用機制[9]，而中藥具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點[10]，因而傳統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法與中藥的研究理念相悖。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)發(fā)展結(jié)合的結(jié)果，其以藥物、靶點以及疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體性的角度出發(fā)，研究中藥的特征，觀察藥物對疾病的影響，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用到中藥中能夠提升中藥研究的現(xiàn)代化水平[11]。程曉平等[12]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了獨活治療骨關(guān)節(jié)的作用機制；李剛等[13]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的分子機制進行了分析；王韌等[14]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子角度分析魚腥草治療支氣管炎的作用機制。因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對薄荷中的活性成分治療慢性膽囊炎的作用機制進行探討，可以提高其治療效果，臨床試驗的成功率以及降低其毒副作用。

1 材料和方法

1.1 薄荷中活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http://tcmspw.com/)，檢索薄荷的化學(xué)成分，并根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出薄荷中可能有效的活性成分。

1.2 潛在治療靶點的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索上述薄荷相關(guān)活性成分的靶點，將其導(dǎo)入Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人類，將檢索得到的所有靶點校正為該靶點的基因名稱，用于后續(xù)其它工作的分析。通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索慢性膽囊炎相關(guān)靶點，將其與上述所得薄荷活性成分靶點進行匹配，得到交集靶點，即為薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的潛在治療靶點。

1.3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將薄荷活性成分與潛在治療靶點導(dǎo)入Cytoscape Version3.7.0軟件，構(gòu)建薄荷活性成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在治療點導(dǎo)入String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，設(shè)置最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果以TSV格式保存，保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)進行分析，保存分析結(jié)果，將節(jié)點大小和顏色設(shè)置用于反映Degree的大小，邊的粗細用于反映Combined score的大小，獲取最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。本研究基于以下參數(shù)：平均最短路徑(Average Shortest Path Length)、介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)、中心接近度(Closeness Centrality)、聚類系數(shù)(Clustering Coefficient)、度值(Degree)，以評估節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.5 生物學(xué)過程與通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點進行生物學(xué)過程與通路分析，將潛在治療靶點輸入數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人類進行分析，取P<0.05，得到生物學(xué)過程與通路分析結(jié)果。

1.6 潛在治療靶點靶點類型歸屬 利用DisGeNET(http://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點進行檢索，將潛在治療靶點依次輸入數(shù)據(jù)庫，獲取靶點類型信息(Protein Class)。

2 結(jié)果

2.1 薄荷中活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得薄荷化學(xué)成分164個，根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出15個潛在的活性成分。詳見表1。

表1 薄荷活性成分信息

2.2 潛在治療靶點的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)檢索薄荷活性成分相關(guān)靶點，將這些靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，進行靶點基因名稱的校正，去重后共得到57個靶點(其中Fortunellin、Linarin無相關(guān)作用靶點)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索得到慢性膽囊炎相關(guān)靶點，將活性成分作用靶點與疾病相關(guān)靶點進行匹配(見圖1)，得到40個潛在治療靶點。

2.3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將薄荷活性成分和潛在治療靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。圖中共涉及53個節(jié)點(13個化合物，40個潛在作用靶點，由于Fortunellin、Linarin無作用靶點，故在網(wǎng)絡(luò)中不體現(xiàn))，69條邊。不同的顏色和形狀代表薄荷活性成分和靶點，綠色菱形節(jié)點代表薄荷活性成分，藍色三角形代表潛在治療靶點，邊代表活性成分與潛在作用靶點之間的關(guān)聯(lián)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存其結(jié)果。保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析，見表2。圖中節(jié)點表示靶點，邊表示靶點之間的聯(lián)系，由圖3可見，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共涉及38個節(jié)點，266條邊(其中PRSS1，CHRM3與其它靶點無相互作用，故沒有在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn))。節(jié)點的大小和顏色表示Degree值的大小，節(jié)點越大，顏色逐漸變深對應(yīng)的Degree值越大。邊的粗細表示Combine score，邊越粗Combine score越大。經(jīng)計算后可知，平均連接度約為14，平均最短路徑長度約為1.71，平均介數(shù)約為0.02，平均聚類系數(shù)約為0.7。具有高度值(連接度)和介數(shù)中心的靶點可被認為是中心靶點，在此網(wǎng)絡(luò)中，度值和介數(shù)中心均超過平均值的有10個，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG，可認為這10個是薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵作用靶點。

表2 潛在治療靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性表

2.5 生物學(xué)過程與信號通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點進行生物學(xué)過程與信號通路通路分析，設(shè)定P<0.05，篩選靠前的生物過程，主要包括對類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)(response to acid chemical)、上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、對銨離子的響應(yīng)(response to ammonium ion)、血液循環(huán)(blood circulation)、細胞對過氧化氫的反應(yīng)(cellular response to hydrogen peroxide)等。潛在治療靶點主要富集在13條信號通路，包括Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、Breast cancer、HIF-1 signaling pathway等信號通路。分析結(jié)果見圖4。

2.6 潛在治療靶點 靶點類型歸屬將40個潛在治療靶點依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲取其對應(yīng)的類型，詳見表3。結(jié)果表明薄荷活性成分治療慢性膽囊炎過程中有信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白、酶等物質(zhì)的參與。

表3 潛在治療靶點的類型歸屬

3 結(jié)論與討論

薄荷具有保肝利膽的作用，是治療慢性膽囊炎的有效藥物，以其揮發(fā)油作為主要成分的藥物在治療膽囊相關(guān)疾病已有報道[5]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)理念和技術(shù)，本研究對薄荷治療慢性膽囊炎作用機制進行了預(yù)測，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道篩選得到有效活性成分15種，獲取活性成分靶點，將其與慢性膽囊炎相關(guān)的靶點取交集，共得到40個潛在治療靶點，將潛在治療靶點作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG在網(wǎng)絡(luò)的中心位置，具有較高的Degree值和介數(shù)中心性，可能為薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵靶點。表皮生長因子(EGFR)是原癌基因的一種表達產(chǎn)物，其表達部位在細胞質(zhì)與細胞膜上，在慢性膽囊炎的組織中，EGFR的陽性表達率約為20%[15]；c-Myc是MYC原癌基因族中的一員，c-Myc被異常激活后，其表達明顯升高，引起細胞增殖，同時抑制有關(guān)分化的基因表達，降低細胞的終末分化[16]；IL6是炎癥性細胞因子，反應(yīng)了機體對炎癥及感染時的反應(yīng)狀態(tài)，而慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中IL6呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[17]。

潛在治療靶點涉及凋亡過程的負調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程、積極調(diào)控成纖維細胞增殖等生物過程；核、基底外側(cè)質(zhì)膜、細胞質(zhì)等細胞組成；類固醇結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合等分子功能。通路分析結(jié)果顯示，薄荷治療慢性膽囊炎的靶點主要涉及Pathwaysincancer、prostatecancer、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications、PI3K-Aktsignalingpathway、Breastcancer、HIF-1signalingpathway等信號通路。

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究薄荷治療慢性膽囊炎的潛在作用機制，從而探明了薄荷在治療慢性膽囊炎的作用靶點及信號通路，并明確了薄荷通過多種活性成分對多種靶點發(fā)揮其治療慢性膽囊炎的作用機制，這為后續(xù)薄荷在慢性膽囊炎治療上的應(yīng)用提供了方向。