廣金錢草多酚的提取工藝及其抗氧化能力的研究

張素斌 陳淑蘭 于冰冰

摘? ? 要：為研究廣金錢草多酚的提取條件及其抗氧化能力，通過單因素試驗和正交試驗研究提取溶劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時間、溫度、提取次數(shù)對廣金錢草多酚提取的影響。結(jié)果表明，最佳提取條件為：40%乙醇，料液比（g·mL-1）1∶40，在40 ℃浸提40 min，多酚得率為（5.20±0.11） mg·g-1。廣金錢草多酚對DPPH·自由基、超氧陰離子自由基及亞硝酸根離子的半抑制濃度IC50分別為（1.94±0.02），（40.48±0.48），（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc對DPPH·自由基、超氧陰離子自由基及亞硝酸根離子的半抑制濃度IC50分別為（6.17±0.03），（136.0±1.9），（188.6±7.3） μg·mL-1，表明廣金錢草多酚抗氧化能力強于Vc。

關(guān)鍵詞：廣金錢草;多酚;提取工藝;抗氧化能力

中圖分類號： R284.2? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.001

Extraction Technology and Antioxidant Capacity of Polyphenols from Desmodium styracifolium （Osbeck） Merr.

ZHANG Subin， CHEN Shulan， YU Bingbing

（School of Food and Pharmaceutical Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061， China）

Abstract： In order to study extraction technology and antioxidant capacity of polyphenols from Desmodium styracifolium， the factors such as extraction solvent， ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction time， temperature and extraction times were investigated by single factor and orthogonal test. Results showed that the maximum extraction rate of polyphenols was （5.20±0.11） mg·g-1， which was obtained by 40% aqueous ethanol with solid-liquid ratio at （g·mL-1）1∶40， 40 ℃ and 40 min. Ability to scavenge free radicals such as DPPH·， O2-· and NO2- of polyphenols extracted from Desmodium styracifolium were determined as （1.94±0.02）， （40.48±0.48）， （134.0±7.6） μg·mL-1 respectively， and which of Vc were determined as （6.17±0.03）， （136.0±1.9）， （188.6±7.3） μg·mL-1 respectively. Results indicated that polyphenols extracted from Desmodium styracifolium. styracifolium exhibited higher antioxidant capacity than Vc.

Key words： Desmodium styracifolium; polyphenols; extraction; antioxidant capacity

廣金錢草（Desmodium styracifolium （Osbeck） Merr.）為豆科、山螞蝗屬植物，別名馬蹄香、銅錢草、假花生等[1]，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南等地，有利濕退黃、利尿通淋的作用，常用于治療尿路結(jié)石、尿路感染、黃疸肝炎等病癥[2-3]。它主要含有黃酮、酚類、生物堿、萜類以及多糖等成分[3]。對廣金錢草的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究主要集中在藥理[4]和成分[5]等方面。從廣金錢草中鑒別出含有vicenin-1、夏佛塔苷和vicenin-3[6]、香橙素[7]等黃酮類，香草酸、阿魏酸等酚酸類[7-8];對其活性成分的研究主要是對黃酮類的研究，也多為黃酮類的提取純化[9-10]，至目前仍未見有對廣金錢草多酚提取及抗氧化能力方面的文獻(xiàn)研究。多酚由于其獨特的多元酚羥基結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、抗腫瘤和抑菌等功效，亦可作為抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[11]。

近年來對植物多酚的研究不斷深入[12-13]。本研究通過單因素和正交試驗研究了廣金錢草多酚的提取條件，通過測定廣金錢草多酚清除DPPH·自由基、超氧陰離子自由基和亞硝酸根離子的能力，以Vc為對照，評價廣金錢草多酚的抗氧化能力。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

廣金錢草干品，購于肇慶市橋東市場。

乙醇、抗壞血酸、酒石酸鉀鈉（AR），廣州化學(xué)試劑廠;沒食子酸（AR），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;硫酸亞鐵（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH）， Sigma-Aldrich。

酒石酸亞鐵溶液：準(zhǔn)確稱取硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.1 g和酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O·4H2O）0.5 g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，備用。

754型紫外可見光分光光度計，上海菁華科技有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;AUY120型電子分析天平，日本島津公司;PHS-25（數(shù)顯）pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取0.05 mg·mL-1沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)液 0，1，2，3，4，5 mL，分別置于刻度試管中，加2 mL酒石酸亞鐵溶液，2 mL pH值7.5的磷酸緩沖溶液，加水至10 mL，放置10 min，用1 cm比色皿，以空白試劑做參比，在540 nm處測定吸光值A(chǔ)。以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度c（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。

1.2.2 廣金錢草多酚的提取方法與多酚含量的測定? 取廣金錢草樣品，除去雜質(zhì)，粉碎，過30目篩，密封備用。測得其水分含量為5.69%。

對提取溶劑（水、50%甲醇、50%乙醇）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%，30%，40%，50%，60%，70%）、料液比（g·mL-1）（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60）、提取時間（20，40，60，80，100 min）、提取溫度（30，40，50，60，

70，80 ℃）以及提取次數(shù)（1，2，3次）這幾個因素進(jìn)行單因素試驗。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度和時間為廣金錢草多酚的4個影響因素，每個因素設(shè)3個水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗。

稱取廣金錢草樣品1 g，放入錐形瓶中，按上述單因素及正交試驗設(shè)定的條件加入提取劑，放入水浴鍋中，恒溫提取一定時間，取出冷卻，過濾，洗滌殘渣，濾液合并定容至50 mL。吸取提取液適量按“1.2.1”的方法測定，計算多酚得率：

多酚得率（mg·g-1）= c×V×n/m

式中：c為樣液多酚的質(zhì)量濃度，mg·mL-1;V為提取液體積，mL;n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 廣金錢草多酚對DPPH·自由基清除能力的測定 按最佳條件提取廣金錢草多酚，適當(dāng)濃縮，所得樣液用于進(jìn)行抗氧化試驗。參照參考文獻(xiàn)[14]的方法稍作修改，將1.27×10-4 moL·L-1 DPPH·的無水乙醇溶液2 mL和樣液2 mL混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度。同時測定Vc清除DPPH·自由基的能力。清除率按下式計算：

清除率（%）=[1-]×100

式中：A1為樣液與DPPH·溶液的吸光度;A2為樣液的吸光度;A3為DPPH·溶液的吸光度。

1.2.4 廣金錢草多酚對超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法，參照參考文獻(xiàn)[15]的方法，取2 mL樣液進(jìn)行清除超氧陰離子自由基的試驗，測定反應(yīng)體系在324 nm處的吸光度。同時對Vc進(jìn)行清除超氧陰離子自由基的試驗。清除率按下式計算：

清除率（%）=[1-]

式中：A1為樣液與鄰苯三酚的吸光度;A2為樣液的吸光度;A3為鄰苯三酚的吸光度。

1.2.5 廣金錢草多酚對亞硝酸根離子清除能力的測定 采用鹽酸萘乙二胺法，參照參考文獻(xiàn)[16]的方法，并稍加改進(jìn)。取5 mL樣液于10 mL刻度試管中，加入1.5 μg·mL-1 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0 mL，放置15 min，然后加入0.4%對氨基苯磺酸1 mL，搖勻，放置5 min，加入0.2%鹽酸萘乙二胺0.5 mL，加水至刻度，放置15 min，以試劑空白為參比，在538 nm處測定吸光值。同時測定Vc清除亞硝酸根離子的能力。清除率按下式計算：

清除率（%）=×100

式中：A1為不加樣液空白對照的吸光度;A2為加入樣液反應(yīng)后的吸光度;A3為樣液本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣金錢草多酚提取的單因素試驗

2.1.1 提取劑的影響 由圖1可以看出，在3種提取溶劑中，50%乙醇與50%甲醇所得多酚無顯著差異，以水為提取溶劑多酚得率最小，這可能是因為廣金錢草中的多酚物質(zhì)極性較小，因而在水中的溶解度較低。綜合比較幾種溶劑的多酚得率并考慮到甲醇的毒性，本試驗選擇乙醇為提取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 從圖2知，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，廣金錢草多酚的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時，廣金錢草多酚的得率最高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)再增大，得率逐漸降低。多酚是多羥基酚類化合物的混合物，不同的物質(zhì)其多酚物質(zhì)的組成不同，因而極性不同，需要選擇與其極性相適應(yīng)的溶劑使其溶出率最高。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%最適合提取廣金錢草多酚。

2.1.3 料液比的影響 由圖3可以看出，料液比（g·mL-1）從1∶10到1∶30，廣金錢草多酚的得率逐漸增加，說明增加溶劑用量有助于多酚類物質(zhì)的溶出;但料液比繼續(xù)增大，多酚得率反而稍微降低，說明多酚類物質(zhì)已基本提取完全，繼續(xù)增大溶劑用量作用不大。所以料液比確定為1∶30。

2.1.4 提取溫度的影響 從圖4可以看出，隨著溫度的升高，廣金錢草多酚的得率先增加后逐漸降低，可能是溫度越高，多酚物質(zhì)越不穩(wěn)定。在40 ℃時得率最高，所以選擇提取溫度為40 ℃。

2.1.5 提取時間的影響 從圖5可以看出，廣金錢草多酚的得率隨時間的延長先升高降低，60 min 時得率最高，可能是提取時間長會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化等反應(yīng)使其結(jié)構(gòu)被破壞。后續(xù)試驗選擇提取時間為60 min。

2.1.6 提取次數(shù)的影響 由圖6可以看出，隨著提取次數(shù)增加，廣金錢草多酚的得率無顯著增加，提取1次已基本可將廣金錢草多酚提取完全，增加提取次數(shù)的意義不大且使成本增加。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表1。極差分析結(jié)果表明，料液比對廣金錢草多酚得率的影響較大，提取時間、溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對廣金錢草多酚得率的影響依次減少。根據(jù)正交表的直觀分析，從廣金錢草中提取多酚的最佳方案為A2B3C2D1，即40%乙醇，料液比（g·mL-1）1∶40，提取溫度40 ℃，提取時間40 min，按此最佳提取條件進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣金錢草多酚得率為（5.20±0.11） mg·g-1。

2.3 廣金錢草多酚對DPPH·自由基清除能力的測定

DPPH·自由基清除試驗是評價天然產(chǎn)物抗氧化活性的一種常用方法。半抑制濃度IC50值可用于評價物質(zhì)的抗氧化活性，IC50值越大，抗氧化性越小[17]。由圖7可以看出，廣金錢草多酚以及Vc都能清除DPPH·自由基，且在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH·自由基的清除能力都隨質(zhì)量濃度的升高逐漸增強。廣金錢草多酚對DPPH·自由基的半抑制濃度IC50為（1.94±0.02） μg·mL-1，Vc對DPPH·自由基的半抑制濃度IC50值為（6.17±0.03） μg·mL-1，由此看出廣金錢草多酚對DPPH·自由基的清除能力大于Vc。

2.4 廣金錢草多酚對超氧陰離子自由基清除能力的測定

堿性條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)生成超氧陰離子，這又會加速鄰苯三酚的氧化，生成有顏色的中間產(chǎn)物，當(dāng)有抗氧化劑存在時可清除超氧陰離子，將使反應(yīng)溶液的吸光度減小[18]。由圖8可以看出，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，廣金錢草多酚與Vc對超氧陰離子自由基的清除能力都隨質(zhì)量濃度的增大而增大，量效關(guān)系明顯。廣金錢草多酚對超氧陰離子自由基的半抑制濃度IC50為（40.48±0.48） μg·mL-1，Vc對超氧陰離子自由基的半抑制濃度IC50為（136.0±1.9） μg·mL-1，可見廣金錢草多酚對超氧陰離子自由基的清除能力大于Vc。

2.5 廣金錢草多酚對亞硝酸根離子清除能力的測定

亞硝酸鹽在人體內(nèi)可生成強致癌物亞硝胺，因此，清除過量的亞硝酸鹽可維護(hù)人體健康。由圖9可以看出，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)廣金錢草多酚與Vc對亞硝酸根離子的清除能力都隨著質(zhì)量濃度的增大而增強，具有明顯的量效關(guān)系。廣金錢草多酚對亞硝酸根離子的半抑制濃度IC50為（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc對亞硝酸根離子的半抑制濃度IC50為（188.6±7.3） μg·mL-1?？梢姀V金錢草多酚對亞硝酸根離子的清除能力大于Vc。

3 結(jié)論與討論

提取多酚常用的方法是溶劑提取法，該法操作簡單，成本低廉，常用的溶劑有水或者有機溶劑與水的混合溶液[19]。本文選擇水、甲醇水溶液、乙醇水溶液作為提取溶劑，比較三者的提取效果，結(jié)果表明，廣金錢草多酚只用水提取的效果較差，而甲醇、乙醇的水溶液兩種溶劑的提取效果無顯著差異，這可能是因為廣金錢草中的多酚物質(zhì)極性較小，因而在水中的溶解度較低。陳金玉等[20]的研究結(jié)果表明，龍眼核多酚提取量的高低順序依次為：70%乙醇溶液>甲醇>水，與本文研究結(jié)果基本一致，而涂宗財?shù)萚21]的研究結(jié)果表明，不同溶劑提取物中紅薯葉總酚含量的大小順序為：水=甲醇>乙醇，與本研究結(jié)果不同，可能是樣品種類不同，其多酚的組成不同，不同溶劑的提取效果就不同。本文采用乙醇水溶液作為提取溶劑，這與一些文獻(xiàn)提取多酚所選用的溶劑[20，22-23]一致，本文研究表明，40%的乙醇溶液為廣金錢草多酚的最合適提取溶劑，乙醇濃度過大或過小，會造成樣品中多酚物質(zhì)無法有效溶出。在料液比（g·mL-1）1∶40、溫度40 ℃、時間40 min的條件下，提取1次即可提取完全并得到最好的提取效果，多酚得率為（5.20±0.11）? mg·g-1。

近年來，天然產(chǎn)物的研究熱點之一就是從植物中尋找抗氧化活性成分。評價多酚抗氧化性的方法有清除DPPH·自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸根離子、羥基自由基以及總還原力等方法，本文選取了前三種方法作為評價廣金錢草多酚抗氧化活性的方法。本文研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，廣金錢草多酚清除DPPH·的能力隨質(zhì)量濃度增加而增大，廣金錢草多酚清除DPPH·的半抑制濃度IC50為（1.94±0.02） μg·mL-1，Vc的IC50則為（6.17±0.03） μg·mL-1。曹偉偉等[24]的研究表明，花生紅衣多酚與Vc清除DPPH·的IC50分別為4.61 μg·mL-1、10.26 μg·mL-1，卜凡瓊等[25]的研究表明，徐香獼猴桃多酚與Vc清除 DPPH·的IC50 分別為3.5 μg·mL-1、3.9 μg·mL-1，鄧疆等[26]的研究表明，印度黃檀葉多酚與Vc清除DPPH·的IC50分別為3.2 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1，說明廣金錢草多酚與花生紅衣、徐香獼猴桃一樣，清除DPPH·的能力都強于Vc，且其清除DPPH·的能力強于花生紅衣、徐香獼猴桃以及印度黃檀葉三種植物的多酚。廣金錢草多酚清除 O2-·的IC50為（40.48±0.48） μg·mL-1，Vc的IC50則為（136.0±1.9） μg·mL-1。卜凡瓊等[25]的研究表明，徐香獼猴桃多酚和Vc清除O2-·的IC50分別為438.6 μg·mL-1、773.1 μg·mL-1，梁杏等[27]的研究表明，核桃餅粕多酚和Vc清除O- 2·的IC50 分別為202.83 μg·mL-1、41.94 μg·mL-1，洪璇等[28]的研究表明，雞桑葉多酚和Vc清除O2-·的IC50分別為 416.05 μg·mL-1、244.21 μg·mL-1。由此說明廣金錢草多酚清除O2-·的能力強于徐香獼猴桃多酚、核桃餅粕多酚以及雞桑葉多酚。廣金錢草多酚清除亞硝酸根離子的IC50為（134.0±7.6） μg·mL-1，Vc的IC50為（188.6±7.3） μg·mL-1。林棟等[29]的研究表明，貴長獼猴桃多酚與Vc對亞硝酸鹽清除作用的IC50 分別為77 μg·mL-1、159 μg·mL-1，馬婷婷等[30]的研究表明，黃參莖葉多酚清除亞硝酸鹽的能力低于Vc ，謝碧秀等[31]的研究表明，油橄欖果渣多酚對于亞硝酸鹽的清除能力低于Vc。由此可見廣金錢草多酚清除亞硝酸根離子的能力低于貴長獼猴桃多酚，但強于黃參莖葉多酚和油橄欖多酚。

廣金錢草中的多酚含量（5.20±0.11 mg·g-1）低于花生紅衣（173.2 mg·g-1）[24]、印度黃檀葉（30.8? mg·g-1）[26]、雞桑葉（87.63 mg·g-1）[28]、黃參莖葉（82.9 mg·g-1）[30]中的多酚含量，高于徐香獼猴桃（0.623 5 mg·g-1）[25]與貴長獼猴桃（3.03±0.07 mg·g-1）[29]中的多酚含量，但廣金錢草多酚除了清除亞硝酸鹽的能力比貴長獼猴桃弱以外，清除DPPH·的能力強于花生紅衣多酚、徐香獼猴桃多酚以及印度黃檀葉多酚，清除O2-·的能力強于徐香獼猴桃多酚、核桃餅粕多酚以及雞桑葉多酚，因此，廣金錢草多酚的含量雖然并不高，但其抗氧化能力較強，可能是由于不同植物多酚的組成不同引起的。綜上所述，在所選擇的三種抗氧化體系中，廣金錢草多酚的半抑制濃度IC50均比Vc的IC50小，說明其與Vc相比，具有更高的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑。

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