LC–MS／MS 法測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1 的含量及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

李樹，師超，郭宇姝

(解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100048)

人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，如神經(jīng)保護(hù)作用、防護(hù)應(yīng)激損傷、抑制腫瘤細(xì)胞、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等［1–3］。以往研究已有關(guān)于使用高效液相色譜–紫外檢測(cè)(HPLC–UV)和液相色譜–質(zhì)譜(LC–MS)以及液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜(LC–MS／MS)技術(shù)，測(cè)定服用人參皂苷混合物或含人參的中藥方劑(如參麥注射液和開心散)后GRb1成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為的報(bào)道［4–7］。但中藥成分復(fù)雜，組分間存在相互作用，會(huì)影響GRb1的代謝動(dòng)力學(xué)行為［8］。有人對(duì)服用GRb1單體后的代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究［9］，但定量限較高，為20 ng／mL［10］?？蛋驳龋?1］采用梯度洗脫，單個(gè)樣品的分析時(shí)間較長(zhǎng)。在上述報(bào)道中，樣品預(yù)處理均采用常規(guī)方法?？紤]到代謝動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中，常規(guī)的樣品預(yù)處理手段在處理大量生物樣品時(shí)效率較低，而基于96 孔板的樣品預(yù)處理技術(shù)可以明顯提高樣品處理的效率和通量［12］。因此筆者應(yīng)用基于96 孔板的高效血漿樣品處理手段，采用LC–MS／MS 法測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的含量，方法快速、靈敏，將其應(yīng)用于大鼠口服人參皂苷Rb1后的代謝動(dòng)力學(xué)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：6410 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

高速低溫離心機(jī)：GTR16-2 型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

96 孔板系統(tǒng)：美國(guó)瓦里安公司；

渦旋振蕩器：VORTEX 4 型，德國(guó)IKA 公司；電子分析天平：BT–25 S 型，感量為0.000 01 g，德國(guó)Sartourious 公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，美國(guó)密理博公司；

人參皂苷Rb1對(duì)照品：純度為98%，批號(hào)為J1229008，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

人參皂苷Rg1對(duì)照品：純度大于98%，批號(hào)為I1228039，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，德國(guó)默克公司；

SD 大鼠：體重270～320 g，雌雄各半，合格證號(hào)：SCXK(京)2009–0007，北京華阜康生物科技股份有限公司；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

1.2 儀器工作譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB–C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25)；流量：0.2 mL／min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；干燥氣：N2，流量為11 L／min；干燥氣溫度：350℃；檢測(cè)離子對(duì)：人參皂苷Rb1(m／z 1 131.5 →365.1)，內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1(m／z 823.3 →643.4)；碰撞電壓：60 eV(人參皂苷Rb1)，40 eV(人參皂苷Rg1)。

1.3 溶液配制

精密稱取10.0 mg 人參皂苷Rb1，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的人參皂苷Rb1儲(chǔ)備液。精密移取Rb1儲(chǔ)備液適量，配成20，40，100，300，1 000，3 000，10 000 ng／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將人參皂苷Rb1的工作溶液，用空白血漿進(jìn)行稀釋得到人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為1，2，5，15，50，150，500 ng／mL 的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。質(zhì)控樣品依照相同的方法進(jìn)行稀釋配制，人參皂苷Rb1的質(zhì)量濃度分別為2，20，400 ng／mL。

精密稱取10.0 mg 內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到1 mg／mL的人參皂苷Rg1儲(chǔ)備液，精密移取Rg1儲(chǔ)備液適量，配成200 ng／mL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.5 血漿樣品預(yù)處理

血漿樣品的預(yù)處理在96 孔板上結(jié)合8 道移液器完成。將100 μL 系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白血漿樣品、質(zhì)控樣品等分別加入到96 孔板中，并加入內(nèi)標(biāo)工作溶液5 μL(空白血漿樣品除外)，渦旋混合30 s 后，加入0.1 mol／L 的NaOH 溶液10 μL，渦旋混勻。在上述溶液中加入正丁醇0.5 mL，振搖提取2 min，在2 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心10 min后，于–20℃冷凍1 h，移取上層有機(jī)溶劑0.4 mL 至另一板中，于45℃下用氮?dú)獯蹈?，?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣分析。

1.6 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

6 只大鼠，雌雄各半，禁食過(guò)夜，灌胃給予5 mg／kg 的人參皂苷Rb1。于給藥前及給藥后0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24，36，48，72 h，眼眶取血約0.3 mL，置于肝素化的離心管中，離心分取血漿，于–20℃下保存。所得的血藥濃度–時(shí)間數(shù)據(jù)以非房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜–質(zhì)譜條件優(yōu)化

在液相色譜條件優(yōu)化過(guò)程中，綜合考慮分離度、色譜峰對(duì)稱性、保留時(shí)間等因素，圍繞流動(dòng)相組成及甲酸、乙酸等添加劑的種類及含量展開，最終確定以甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25)為流動(dòng)相。通過(guò)比較人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)在正、負(fù)兩種離子檢測(cè)方式下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩種待測(cè)成分在正離子模式下的響應(yīng)明顯優(yōu)于負(fù)離子模式，因此選擇正離子模式。通過(guò)對(duì)人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)分子離子峰［M+Na］+分別為m／z 1 131.5 和 m／z 823.3。采用儀器自帶的Masshunter Optimizer (Version B.04.01)軟件進(jìn)行二級(jí)碎片的掃描和優(yōu)化，最終確定人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的定量離子反應(yīng)分別為1 131.5 →365.1，823.3 →643.4，最優(yōu)碰撞電壓分別為60，40 eV。圖1 為人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的一／二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖1 人參皂苷Rb1(A)和內(nèi)標(biāo)(B)的一／二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 方法專屬性

在選擇提取溶劑時(shí)，對(duì)液–液萃取過(guò)程中有機(jī)溶劑的組分進(jìn)行考察。比較了正丁醇、乙酸乙酯以及二者不同比例混合液作為提取溶劑時(shí)對(duì)血漿樣品提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)正丁醇提取回收率高，基質(zhì)效應(yīng)少，因此最終采用正丁醇作為提取溶劑。將5 個(gè)不同個(gè)體的大鼠血漿及標(biāo)準(zhǔn)添加血漿按1.5 進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，色譜圖見圖2。如圖2 所示，人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.8 min 和1.3 min，血漿中的內(nèi)源性成分不干擾目標(biāo)成分的出峰位置。

圖2 大鼠血漿中的人參皂苷Rb1 和內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1 的色譜圖

2.3 線性方程、線性范圍和定量限

通過(guò)測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度點(diǎn)，以人參皂苷Rb1與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(y)對(duì)濃度(x)進(jìn)行線性回歸，以1／x 為加權(quán)系數(shù)。測(cè)得人參皂苷Rb1的線性范圍為1～500 ng／mL，回歸方程為y=0.053 96x+0.004 045，r2=0.999 5，定量限為1 ng／mL。精密度為8.2%，準(zhǔn)確度為113.4%。對(duì)于濃度超出線性范圍的血漿樣品，用空白血漿進(jìn)行10 倍稀釋后并重新測(cè)定，對(duì)稀釋效應(yīng)進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)10 倍稀釋后，對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性沒有影響。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定低、中、高3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，計(jì)算大鼠血漿中人參皂苷Rb1的批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

提取回收率反映了生物樣品中目標(biāo)化合物的提取效率，是評(píng)價(jià)生物樣品分析方法的重要指標(biāo)之一［13］?；|(zhì)效應(yīng)是指在LC–MS／MS 分析測(cè)定中，色譜分離時(shí)共洗脫物可能影響目標(biāo)化合物的離子化效率，引起信號(hào)抑制或增強(qiáng)。生物樣品中存在大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)，因此在對(duì)生物樣品進(jìn)行LC–MS／MS分析測(cè)定時(shí)，必須對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)地考察［14］。通常有兩種方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法［15］和標(biāo)準(zhǔn)添加法［16］。設(shè)置低、中、高3 個(gè)濃度考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高3 個(gè)濃度的大鼠血漿質(zhì)控樣品測(cè)得的色譜峰面積為M1；空白血漿樣品經(jīng)提取后加入對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的色譜峰面積為M2；對(duì)應(yīng)濃度純標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)得的色譜峰面積為M3；計(jì)算回收率為M1與M2的比值，基質(zhì)效應(yīng)為M2與M3的比值。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在低、中、高三個(gè)濃度的回收率分別為80.3%，81.0%，79.7%，基質(zhì)效應(yīng)為96.6%，99.3%，99.3%；內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1的回收率為83.1%，基質(zhì)效應(yīng)為91.4%。證明該方法提取回收率良好，基質(zhì)干擾效應(yīng)小，符合生物樣品分析方法的要求。

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是指在確定條件下，一定時(shí)間內(nèi)待測(cè)物在給定基質(zhì)中的化學(xué)穩(wěn)定性。按照《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014 年5 月頒布)和《中華人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)附錄中生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則的規(guī)定，在方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中，需要對(duì)分析樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。穩(wěn)定性研究主要考察了低、中、高3 個(gè)濃度的QC 樣品在室溫25℃放置4 h、樣品經(jīng)預(yù)處理后置于自動(dòng)進(jìn)樣器8 h、–20℃冷凍條件放置30 天、以及3 次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果表明，大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1在不同條件下的穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析方法的要求。

表2 大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1 在不同條件下的穩(wěn)定性

2.7 大鼠灌胃人參皂苷Rb1 后的代謝動(dòng)力學(xué)研究

大鼠單次灌胃給予5 mg／kg 的人參皂苷Rb1后的平均血藥濃度時(shí)間曲線見圖3。用DAS 2.0 軟件以非房室模型計(jì)算代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)血藥濃度的達(dá)峰時(shí)間tmax為1.53 h，半衰期t1／2為13.54 h，MRT 為26.22 h，AUC0～24為16 237.76 (ng·h)／mL。

圖3 大鼠口服5 mg／kg 人參皂苷Rb1 后的血藥濃度–時(shí)間曲線

3 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用96 孔板系統(tǒng)對(duì)大鼠血漿中的人參皂苷Rb1進(jìn)行液液萃取，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)處理，可以在一塊孔板上完成隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加了樣品處理的平行性，提高了樣品處理效率；采用等度洗脫，單個(gè)樣品的分離時(shí)間為3 min。通過(guò)對(duì)分析方法進(jìn)行優(yōu)化及系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，最終確定定量下限為1 ng／mL。該方法具有快速、高效、靈敏等特點(diǎn)，適用于人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)研究。