固相萃取–液相色譜–質(zhì)譜法測(cè)定益母草中7 種真菌毒素

周穎，唐登峰，李文庭，祝清嵐，馬臨科，昝珂

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310053； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

益母草來源于唇形科植物益母草的新鮮或干燥地上部分，是臨床常用的婦科良藥，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒的功能［1］。2013 年，國家啟動(dòng)第四次資源普查項(xiàng)目，益母草是中藥材資源普查項(xiàng)目的品種之一，鑒于其在采收、儲(chǔ)藏、制備及運(yùn)輸過程中因處理不當(dāng)極易發(fā)生霉變，有被真菌毒素污染的可能，而真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素(OTA)、T–2 毒素(T–2)和展青霉素(Patulin)等，對(duì)人體具有較強(qiáng)毒性，因此有必要加強(qiáng)相關(guān)真菌毒素的控制［1］。為客觀評(píng)價(jià)益母草藥材的質(zhì)量，并為全國中藥資源普查在安全性維度提供數(shù)據(jù)支持［2］，開展益母草中真菌毒素的檢測(cè)分析勢(shì)在必行。

近年來，國內(nèi)外已紛紛開展真菌毒素相應(yīng)的測(cè)定方法及限量要求研究［3–5］。目前文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)中藥材進(jìn)行真菌毒素檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附技 術(shù)［6–7］、膠體金免疫層析技術(shù)［8–10］、薄層色譜技術(shù)［11］、免疫親和柱凈化–高效液相色譜技術(shù)［12–14］和高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)［15–18］等。由于中藥材復(fù)雜基質(zhì)的干擾，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在測(cè)定真菌毒素時(shí)容易產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果，且受試劑盒差異等條件的影響也較大；膠體金免疫層析技術(shù)靈敏度較差，無法精準(zhǔn)定量；薄層色譜技術(shù)前處理過程使用的大量有機(jī)試劑對(duì)人體有較大的傷害，同時(shí)易造成環(huán)境的污染；免疫親和柱凈化–高效液相色譜技術(shù)無法檢測(cè)無熒光和無紫外吸收的真菌毒素；而高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為無需衍生化便可檢測(cè)的分析技術(shù)具有分析速度快，靈敏度高、多種組分可同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為較為廣泛的真菌毒素檢測(cè)技術(shù)。在益母草中真菌毒素的檢測(cè)方面，目前國內(nèi)外對(duì)展青霉素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1和T–2 毒素檢測(cè)分析未見相關(guān)報(bào)道，本研究將樣品中7 種真菌毒素同時(shí)提取，采用固相萃取柱富集凈化，正離子和負(fù)離子切換模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)，建立了高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)益母草中7 種真菌毒素的方法，以期能為客觀評(píng)價(jià)我國益母草藥材的安全性提供技術(shù)支持和重要參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC–20ADXR 型，日本島津公司；

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：ABSCIEXQTRAP 5500 型，配有電噴霧離子源，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

Oasis HLB 固相萃取柱：3 mL，60 mg，美國沃特世公司；

氮?dú)獯蹈蓛x：N–EVAPTM111 型，美國Organomation Associates Inc 公司；

Milli-Q 超純水儀：Milli PAK advantage A10 型，美國密理博公司；

臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)：Centrifuge 5810R 型，德國Eppendorf 公司；

黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液：黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素B1(AFB1)的質(zhì)量濃度分別為0.59，1.18，0.35，1.04 μg／mL，批 號(hào) 為610001–20130，中國食品藥品檢定研究院；

T–2 毒素(T–2)：5 mg，純度為98%，批號(hào)為5–MWC–50–1，加拿大TRC 公司；

赭 曲 霉 毒 素A(OTA)：10 μg／mL，批 號(hào) 為160324，北京曼哈格生物科技有限公司；

展青霉素(Patulin)：101.3 μg／mL，5 mL，批號(hào)為L(zhǎng)15383F，美國Biopure 公司；

乙酸銨：純度不小于98%，美國西格瑪公司；

甲醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國默克公司；

樣品：來源于第四次資源普查收集到的82 批次的益母草，涉及全國10 個(gè)省、市、自治區(qū)，其中有兩批為細(xì)葉益母草(Leonurus sibiricus L)，一批為鬃尾草狀益母草(Leonurus chaituroides C.Y.)，其余均為其它類益母草(Leonurus japonicus Houtt.)；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液，加甲醇配制成AFG2，AFG1，AFB2，AFB1質(zhì)量濃度分別為0.118，0.236，0.07，0.208 μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密量取適量OTA 加入甲醇配制成0.2 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密量取展青霉素，加入乙腈配制成6.078 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取T–2 毒素，用乙腈溶解，配制成4.9 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密量取7 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于–20℃下保存，濃度見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

對(duì)照品溶液：將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液以甲醇稀釋2倍后制成對(duì)照品溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色譜柱：ECLIPSE PLUS C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL／min；進(jìn)樣量：5 μL；以5 mmol／L 乙酸銨為流動(dòng)相A 相，以乙腈為流動(dòng)相B相，按表2 洗脫條件進(jìn)行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜

電噴霧離子源；正負(fù)離子切換掃描模式；電離電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣流量：30 L／min；碰撞氣流量：5 L／min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集；7 種真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時(shí)間見表3。

表3 7 種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時(shí)間

1.4 樣品處理

精密稱取益母草樣品粉末3 g(過二號(hào)篩)，加入70%甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，離心5 min，吸取上清液10 mL，用水稀釋至20 mL，搖勻。吸取稀釋后的溶液2.5 mL，緩慢通過已經(jīng)處理好的固相萃取柱(依次用甲醇和水各3 mL 洗脫)，收集流出的溶液；然后用2.5 mL 甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，合并之前收集的溶液，用45℃氮?dú)饩徛抵良s1 mL，加入乙腈溶液至2 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得待測(cè)樣品溶液。

2 結(jié)果及討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

在對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化過程中，考察了是否含有乙酸銨對(duì)優(yōu)化結(jié)果的影響。結(jié)果表明，用純水作為流動(dòng)相時(shí)，OTA 的響應(yīng)極弱，以致無法確定特征母離子和子離子，用乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，OTA 的響應(yīng)信號(hào)明顯提高，因此最終選擇5 mmol／L 乙酸銨溶液–乙腈作為流動(dòng)相體系。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的真菌毒素相對(duì)較多，為了將殘留在色譜柱上化合物充分洗脫，同時(shí)縮短分析時(shí)間，選用梯度洗脫的方法。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

在提取方式上，分別考察了超聲和均質(zhì)兩種方式。結(jié)果表明，超聲和均質(zhì)提取回收率基本相當(dāng)，故選擇簡(jiǎn)單易行的超聲方法進(jìn)行提取。在定容樣品時(shí)，分別考察了直接定容至5 mL 和濃縮后定容至2 mL兩種提取回收結(jié)果，結(jié)果表明直接定容至5 mL 響應(yīng)信號(hào)太小，濃縮后定容至2 mL 響應(yīng)信號(hào)顯著增大，故選用濃縮后定容的方式。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

精密吸取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 μL 進(jìn)樣，按1.3 儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以各組分真菌毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程和相關(guān)系數(shù)，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度作為方法檢出限，結(jié)果見表4。由表4可知，7 種真菌毒素的質(zhì)量濃度與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。

表4 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取益母草陰性樣品粉末約3 g(過二號(hào)篩)，精密稱定，加入70%甲醇溶液和混合對(duì)照品溶液各15 mL，按照1.4 進(jìn)行處理，在1.3 條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。由表5 可知，7 種真菌毒素的回收率在72.8%～95.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～5.7%。7 種真菌毒素的TIC 圖見圖1，7 種真菌毒素的MRM 色譜圖見圖2。

表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣品測(cè)定

對(duì)收集到的82 批益母草樣品按本方法進(jìn)行測(cè)定，有3 批益母草樣品中檢出OTA，分別為1.6，1.2，3.9 μg／kg，其它6 種真菌毒素未見檢出。

3 結(jié)語

采用固相萃取柱富集凈化，以液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用方法同時(shí)檢測(cè)益母草中7 種真菌毒素。該方法高效、快速、準(zhǔn)確，可滿足益母草中真菌毒素的大通量快速篩查和確證。

圖1 7 種真菌毒素的TIC 圖

圖2 7 種真菌毒素的MRM 色譜圖