魚(yú)鰾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升

段秀俊，劉 培，楊 超，孫銘憶，何娟娟，范姣姣，段青青

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

魚(yú)鰾又名魚(yú)白、魚(yú)脬、魚(yú)肚，為石首魚(yú)科動(dòng)物大黃魚(yú)Pseudosciaena crocea（Richardson）、小黃魚(yú)Pseudosciaena polyactisBleeker，或鱘科動(dòng)物中華鱘Acipenser sinensisGray、鰉魚(yú)Huso dauricus（Georgi）等魚(yú)鰾［1-2］，其藥用始載于《本草拾遺》［3］，性平味甘，歸腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、滋養(yǎng)筋脈、止血、散瘀、消腫之功效，用于腎虛滑精、產(chǎn)后風(fēng)痙、破傷風(fēng)、吐血、血崩、創(chuàng)傷出血、痔瘡等［2］。它不僅是一味具有滋補(bǔ)作用的中藥，而且食用歷史悠久，《齊民要術(shù)》 中就有加工食用石首魚(yú)鰾（黃花魚(yú)一類(lèi)） 的記載，唐代已被列為貢品，明代開(kāi)始在民間普遍食用［4］，其富有膠質(zhì)，與燕窩、魚(yú)翅齊名，為 “ 海洋八 珍” 之 一，譽(yù) 之 “ 海 洋人參”［5］。

目前，魚(yú)鰾被山西、山東、湖南等地藥材標(biāo)準(zhǔn)所收載，但缺少顯微鑒別及基于色譜分析的含有量測(cè)定［2，6-8］，溫俊達(dá)等［9］曾作過(guò)相應(yīng)考察，但也未涉及上述項(xiàng)目。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)魚(yú)鰾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，鑒別項(xiàng)目包括性狀、顯微、TLC，檢查項(xiàng)目包括水分、總灰分、酸不溶性灰分，含有量測(cè)定包括總氮、17 種常見(jiàn)氨基酸，以期為該藥材現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升，以及市場(chǎng)質(zhì)量監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 101A-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）；SX2-4-10 型馬弗爐（上海亞明熱處理設(shè)備有限公司）；EL204 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；BX53 型正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；DN-04C 型凱氏定氮儀（浙江托普儀器有限公司）；L-8900 型氨基酸自動(dòng)分析儀（日本Hitachi 公司）；25 mL 酸式滴定管；定量濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）；定性濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 精氨酸對(duì)照品（批號(hào)110872-201207，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氨基酸混合物對(duì)照品［批號(hào)KPP5222，含天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸 （Ser）、谷氨酸 （Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸 （Ala）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、絡(luò)氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴(lài)氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg） 17 種常規(guī)蛋白水解液層析純氨基酸，每種濃度為2.50 μmol／mL］、茚三酮溶液（批號(hào)KQF6365）、茚三酮緩沖液 （批號(hào)KQF6365）（日 本 Wako 公 司）；流動(dòng)相 PH-1 （批 號(hào)A5259H1）、PH-2 （批號(hào)A5259H2）、PH-3 （批號(hào)A5259H3）、PH-4 （批號(hào)A5259H4）、PH-RG （批號(hào)A5259RG）。硅膠薄層板（青島海洋化工廠分廠，煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠試驗(yàn)廠）。魚(yú)鰾共11 批，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品，信息見(jiàn)表1。鹽酸、氫氧化鈉為分析純；液氮純度大于99.99%；水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀 本品呈長(zhǎng)圓形薄片或紡綞形筒狀或小方塊狀，黃白色、淡黃色或黃棕色，角質(zhì)樣，略有光澤，半透明；質(zhì)堅(jiān)韌，不易撕裂，裂斷處呈纖維性，氣微腥，味淡。本實(shí)驗(yàn)比較了海魚(yú)、河魚(yú)魚(yú)鰾的性狀區(qū)別，主要體現(xiàn)在形狀、大小、顏色等方面，見(jiàn)表2、圖1。

2.1.2 顯微 200 倍顯微鏡下，能明顯觀察到魚(yú)鰾粉末中蛋白、平滑肌纖維，見(jiàn)圖2。其中，蛋白呈球形或類(lèi)球形，有的聚集成團(tuán)，有的單個(gè)散在，多數(shù)具有凹陷或裂隙；平滑肌纖維常單個(gè)存在，有的成束成層存在，單個(gè)纖維多呈長(zhǎng)條形，無(wú)橫紋，常扭曲，長(zhǎng)短不一，有的表面光滑，有的肌膜向下凹陷形成數(shù)量眾多的小凹，有的表面帶有毛刺。

表2 2 種魚(yú)鰾性狀區(qū)別Tab.2 Differences of characteristics between two kinds of fish maws

圖1 2 種魚(yú)鰾顏色和形狀Fig.1 Colors and shapes of two kinds of fish maws

圖2 魚(yú)鰾顯微特征（×200）Fig.2 Microscopic features of fish maws （×200）

2.1.3 TLC 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道。取本品粉末0.1 g，加50 mL 稀鹽酸加熱回流2 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 70%乙醇溶解，作為供試品溶液；另取精氨酸對(duì)照品，加70%乙醇制成每1 mL含0.25 mg 該成分的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部0502 薄層色譜法，吸取上述溶液各1 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%茚三酮丙酮溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，供試品色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置上顯示相同顏色斑點(diǎn)。

圖3 魚(yú)鰾TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of fish maws

2.2 檢查

2.2.1 水分 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 四部0832 水分測(cè)定法第二法（烘干法） 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、總氮含有量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab.3 Results of content determination of water，total ash，acid-insoluble ash and total nitrogen （n＝2）

2.2.2 總灰分 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 四部2302 灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3 酸不溶性灰分 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 四部2302 灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 含有量測(cè)定

2.3.1 總氮 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 四部0704 氮測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 氨基酸

2.3.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［10-16］ 報(bào)道。分離柱為離子交換樹(shù)脂2622 柱（4.6 mm×60 mm），反應(yīng)柱為離子交換樹(shù)脂2619 柱 （4.6 mm ×60 mm），除氨柱 為離子 交換樹(shù) 脂 2650 柱（4.6 mm×40 mm）；分離柱流動(dòng)相為B1～B4 （分別為pH 值1、2、3、4 的檸檬酸鈉緩沖液），反應(yīng)柱流動(dòng)相為R1～R3 （為茚三酮溶液及其緩沖液），氨過(guò)濾柱流動(dòng)相為B5～B6 （B5 為純水，B6 為PHRG 緩沖液），梯度洗脫，程序見(jiàn)表4；分離柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃；分離柱體積流量0.400 mL／min，反應(yīng)柱體積流量0.350 mL／min；雙波長(zhǎng)檢測(cè)，VIS 1 檢測(cè)除脯氨酸以外的氨基酸，波長(zhǎng)570 nm，而VIS 2 檢測(cè)脯氨酸，波長(zhǎng)440 nm。進(jìn)樣量20 μL。在此條件下，17 種氨基酸分離效果均良好，見(jiàn)圖4。

表4 梯度洗脫程序Tab.4 Gradient elution programs

2.3.2.2 對(duì)照品溶液制備 吸取40 μL 氨基酸混合物對(duì)照 品母液 （2.50 μmol／mL），加960 μL 0.02 mol／L 鹽酸定容至1 000 μL，混 勻，即 得（0.10 μmol／mL），測(cè)定前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

圖4 各氨基酸色譜圖Fig.4 Chromatograms of various amino acids

2.3.2.3 供試品溶液制備 魚(yú)鰾粉碎后過(guò)5 號(hào)篩，精密稱(chēng)取0.04 g 于25 mL 水解管中，加入10 mL 6.00 mol／L 鹽酸，充氮?dú)?5 min 后封管，110 ℃水解24 h。取出冷卻，濾過(guò)，精密吸取濾液5 mL 于25 mL 三角瓶中，6.00 mol／L NaOH 溶液調(diào)pH 至7.0，將其轉(zhuǎn)移到25 mL 量瓶中，純凈水定容至刻度，精密吸取2.5 mL 于5 mL 量瓶中，0.02 mol／L鹽酸定容至刻度，搖勻，即得，測(cè)定前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.3.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液80 μL，加920 μL 0.02 mol／L 鹽酸混勻，依次2 倍稀釋成0.10、0.05、0.025、0.012 5 μmol／mL，在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測(cè)定。以溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表5，可知17種氨基酸在0.012 5～0.20 μmol／mL 范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表5 各氨基酸線性關(guān)系Tab.5 Linear relationships of various amino acids

2.3.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取0.10 μmol／mL 氨基酸混合物對(duì)照品溶液20 μL，在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面積RSD 分別 為0.15%、0.11%、0.17%、0.15%、0.52%、0.24%、0.26%、0.22%、0.28%、0.30%、0.15%、0.12%、0.26%、0.25%、0.23%、0.21%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)20140310），于 0、2、4、6、8、10 h 在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面積RSD分別為0.62%、0.91%、0.82%、0.52%、1.04%、0.31%、0.43%、0.41%、0.56%、1.06%、0.80%、0.66%、1.27%、0.50%、0.42%、0.71%、0.43%，表明供試品溶液在10 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材 （批號(hào)20140310），按“2.3.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 含有量RSD 分別為0.81%、1.58%、0.74%、0.79%、1.08%、0.44%、1.02%、2.43%、0.23%、1.83%、0.45%、0.59%、2.09%、1.07%、0.19%、0.93%、0.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取17 種氨基酸含有量已知的藥材（批號(hào)20140310） 6 份，每份約0.02 g，精密稱(chēng)定，加入適量對(duì)照品溶液，按“2.3.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 平均加樣回收率分別 為 99.37%、99.33%、98.77%、98.75%、98.07%、100.4%、99.65%、99.87%、101.7%、97.80%、98.95%、99.03%、98.25%、99.23%、100.7%、101.5%、99.78%，RSD 分別為2.26%、2.44%、2.39%、2.29%、2.41%、2.02%、2.31%、2.35%、2.39%、2.09%、2.39%、2.02%、2.29%、2.26%、2.34%、2.34%、2.50%。

2.3.2.9 樣品含有量測(cè)定 取11 批藥材，每批2份，每份約0.04 g，精密稱(chēng)定，按“2.3.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 各氨基酸含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝2）Tab.6 Results of content determination of various amino acids （mg／g， n＝2）

3 討論

目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)海魚(yú)魚(yú)鰾，而鮮有河魚(yú)魚(yú)鰾。本實(shí)驗(yàn)除購(gòu)買(mǎi)了1 批河魚(yú)魚(yú)鰾外，還曾另外購(gòu)買(mǎi)了一些人工養(yǎng)殖大黃魚(yú)及小黃魚(yú)，將其解剖取魚(yú)鰾，干燥后進(jìn)行觀察，但畢竟數(shù)量有限，其性狀特征是否具有市場(chǎng)代表性還有待進(jìn)一步探討。

文獻(xiàn)［9，17］ 報(bào)道，藥材中提取氨基酸的方法大多為70%乙醇直接提取，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用該方法制備的魚(yú)鰾供試品溶液在TLC 上始終無(wú)斑點(diǎn)呈現(xiàn)，后經(jīng)酸水解處理后才清晰顯現(xiàn)，表明魚(yú)鰾中蛋白質(zhì)含有量較高，而游離氨基酸較低。另外，TLC 鑒別時(shí)起初以丙氨酸為對(duì)照品，但在不同展開(kāi)系統(tǒng)中斑點(diǎn)對(duì)齊情況并不理想，故又比對(duì)了9 種常見(jiàn)、價(jià)格適中氨基酸（亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、精氨酸） 與魚(yú)鰾的薄層層析行為，發(fā)現(xiàn)精氨酸斑點(diǎn)重復(fù)性、對(duì)齊性最佳，故選擇其作為對(duì)照品。

本實(shí)驗(yàn)首次考察了魚(yú)鰾顯微特征，但相對(duì)于組織結(jié)構(gòu)明顯的藥材，魚(yú)鰾顯微特征很難考察。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)、查閱書(shū)籍、與生物化學(xué)及病理專(zhuān)家交流后，最終確定魚(yú)鰾粉末中明顯存在的許多條或塊狀物及類(lèi)球形物質(zhì)分別為平滑肌纖維及蛋白質(zhì)，這也是首次對(duì)動(dòng)物此類(lèi)特定組織的顯微特征進(jìn)行研究，以期為以后相關(guān)顯微鑒別研究提供參考。此外還發(fā)現(xiàn)，只有直接刮取魚(yú)鰾表面粉末并不能太細(xì)，才能觀察到相對(duì)完整的平滑肌纖維及蛋白，若按照常規(guī)粉末顯微鑒別制片方法則難以發(fā)現(xiàn)，這可能是之前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道的原因之一。目前，市場(chǎng)上魚(yú)鰾鑒別方法以性狀鑒別為主，但對(duì)性狀接近的偽品尚無(wú)有效的區(qū)分手段，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的顯微特征可快速有效地做到這一點(diǎn)，對(duì)市場(chǎng)監(jiān)控具有積極意義。

文獻(xiàn)報(bào)道，魚(yú)鰾是一種高蛋白、低脂肪，含有豐富氨基酸的水產(chǎn)資源［5］，故本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了其中總氮含有量以此評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)含有量。結(jié)果，11 批魚(yú)鰾總氮含有量介于14.16%～18.45%之間，可見(jiàn)市售品蛋白質(zhì)含有量差異不明顯，并且海魚(yú)、河魚(yú)中亦然，表明不同魚(yú)種魚(yú)鰾的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較接近，也印證了其補(bǔ)益作用。

氨基酸具有多方面機(jī)能調(diào)節(jié)作用，如甘氨酸能維持中樞神經(jīng)，提高免疫力，降低高膽固醇和高血脂；谷氨酸能解除氨對(duì)大腦的毒性，并促進(jìn)消化道黏膜黏蛋白生成；精氨酸能促進(jìn)生育及生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及免疫調(diào)節(jié)能力［18］，故本實(shí)驗(yàn)采用氨基酸分析儀法分析了11 批魚(yú)鰾中17 種氨基酸含有量，并在方法學(xué)考察時(shí)發(fā)現(xiàn)陰性無(wú)干擾，雜質(zhì)及其他成分對(duì)含有量測(cè)定無(wú)影響，專(zhuān)屬性良好。

另外，為了保證收集到的魚(yú)鰾具有廣泛的市場(chǎng)代表性，本實(shí)驗(yàn)購(gòu)買(mǎi)的11 批樣品分別來(lái)自國(guó)內(nèi)三大藥材市場(chǎng)，分別為河北安國(guó)藥材市場(chǎng)4 批、四川荷花池藥材市場(chǎng)4 批、安徽亳州藥材市場(chǎng)3 批，能比較客觀地反映該藥材國(guó)內(nèi)發(fā)展現(xiàn)狀，以期為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供依據(jù)。