FOXC2通過上調(diào)MMP9促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲遷移

姬路鵬 張毅 梁庭都 呂詩敏

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，居我國惡性腫瘤的首位［1］。肺癌中約85%為非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）［2］。NSCLC 惡性程度高、預(yù)后差，盡管針對NSCLC 的靶向治療已取得了顯著療效，但NSCLC 總體的五年生存率仍然較低［3］。如何進(jìn)一步揭示NSCLC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動基因，明確有效的干預(yù)靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)意義。FOX（Forkhead box）家族是由保守氨基酸序列組成的DNA 結(jié)構(gòu)域。FOX 基因家族介導(dǎo)了多種生物學(xué)功能，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控和代謝調(diào)控等，這提示我們FOX 基因家族有可能也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。FOXC2 在血管生成和淋巴管生成過程中發(fā)揮重要作用。盡管最新的研究提示，F(xiàn)OXC2 在腫瘤中的作用越來越凸顯，但目前關(guān)于FOXC2 在NSCLC 中的研究較少，尤其是在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究，而且作用機(jī)制尚未明確。本研究擬在NSCLC 細(xì)胞中過表達(dá)FOXC2 的表達(dá)水平，檢測其對NSCLC 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并初步探討可能的分子機(jī)制，以期為NSCLC 的治療提供可能的新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人NSCLC 細(xì)胞系H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞及正常人支氣管上皮樣細(xì)胞系HBE 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（上海，中國）。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%的胎牛血清FBS（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美 國）的Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基（凱基，南京，中國），所有的培養(yǎng)基中均添加100 μg/ml 青霉素G 和100 μg/ml 鏈霉素（凱基）。細(xì)胞均置于5%CO2、37 ℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR） 應(yīng)用RNAiso Plus 試劑（Takara，大連，中國）從細(xì)胞中提取RNA；然后應(yīng)用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；再以cDNA 為模板，用TB Green?Fast qPCR Mix 實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒（Takara）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)。βactin 作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。FOXC2上游引物序列：5′-CCTCCTGGTATCT CAACCACA-3′，下游引物序列：5′-GAGGGTCGA GTTCTCAATCCC-3′；MMP9 上 游 引 物 序 列：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下 游 引 物 序列：5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′；β-actin 上游引物序列：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下游引物序列：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。1.3 Western blot 用預(yù)冷的PBS 將細(xì)胞清洗2遍；然后用Western blot 細(xì)胞裂解液（碧云天，江蘇，中國）冰上充分裂解細(xì)胞，離心機(jī)12 000 rpm 離心棄掉沉淀，提取總蛋白；BCA 試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度。提取的蛋白質(zhì)采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；然后轉(zhuǎn)膜至甲醇激活的PVDF 膜上；采用5%脫脂奶粉室溫封閉1h；TBST 洗滌5min（3 次）；加 入 相 應(yīng) 的 一 抗 抗 體（FOXC2，Cell Signaling，#12974；β-actin，Cell Signaling，#3700）4℃孵育過夜；TBST 洗滌5min（3 次）；加入對應(yīng)的二抗后室溫下孵育1 h；TBST 洗滌5 min（3 次）；ECL 發(fā)光液（碧云天）曝光，ImageJ 測量條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參灰度值之比反應(yīng)蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-FOXC2 重組質(zhì)粒由上海生工生物公司構(gòu)建。采用Lipofectamine 2000（Thermo Scientific，美國）進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程采用無血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基（Thermo Scientific）；轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞提取RNA 和蛋白質(zhì)通過qRTPCR 和Western blot 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Transwell 胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞；無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并充分混勻；遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個細(xì)胞/200 μl接種于Transwell 小室（Corning，8 μm）；在下室中加入600 μl 含有10% FBS 的完全培養(yǎng)基；置于37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；24 h后用棉簽輕輕擦去上室中的細(xì)胞；4%多聚甲醛中固定5 min；然后用0.01%的結(jié)晶紫溶液（碧云天）染色5 min；最后雙蒸水漂洗后晾干，隨機(jī)選取5 個視野在倒置顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)開始的前1 天，在Transwell 小室內(nèi)加入充分的含有基質(zhì)膠（BD，美國）的DMEM 培養(yǎng)基（基質(zhì)膠∶DMEM 培養(yǎng)基=1∶8）30 μl 于培養(yǎng)箱中過夜待用；細(xì)胞密度為1×105個細(xì)胞/200 μl。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件（IBM，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用（±s）表示，每組數(shù)據(jù)來自3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，采用t 檢驗(yàn)分析各組差異的顯著性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXC2 在人NSCLC 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 為了檢測FOXC2 在NSCLC 中的表達(dá)水平，我們首先通過qRT-PCR 的方法檢測了NSCLC 細(xì)胞系H1299 細(xì)胞、A549 細(xì)胞和人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE 細(xì)胞中FOXC2 的mRNA 表達(dá)水平。通過研究發(fā)現(xiàn)，對比正常人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE，人NSCLC 細(xì)胞系H1299 細(xì)胞、A549 細(xì)胞的FOXC2 的表達(dá)水平較高（P＜0.05，見圖1A）。因A549 細(xì)胞的FOXC2 表達(dá)水平相比H1299 細(xì)胞較低，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用A549細(xì)胞為研究對象。

圖1 FOXC2 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 FOXC2 過表達(dá)促進(jìn)了A549 細(xì)胞侵襲遷移能力 為了探討FOXC2 在NSCLC 中的作用，F(xiàn)OXC2 重組過表達(dá)質(zhì)粒用于構(gòu)建A549-FOXC2 過表達(dá)細(xì)胞模型，過表達(dá)效率通過qRT-PCR 和Western blot 進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組（pcDNA-vector）相比，NSCLC 細(xì)胞A549 的FOXC2的mRNA 和蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05，見圖1BC）。為了探討FOXC2 對于NSCLC 細(xì)胞A549 侵襲遷移能力的影響，通過Transwell 實(shí)驗(yàn)探討A549 在過表達(dá)FOXC2 前后侵襲遷移能力的變化。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXC2 明顯促進(jìn)了NSCLC 細(xì)胞A549 的侵襲遷移能力（P＜0.05，見圖2A）。

圖2 FOXC2 過表達(dá)促進(jìn)了A549 細(xì)胞的侵襲遷移

2.3 FOXC2 過表達(dá)上調(diào)了MMP9 的表達(dá) 通過qRT-PCR 法 檢 測 過 表 達(dá)FOXC2 后，NSCLC 細(xì) 胞A549 的MMP9 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相比對照組pcDNA-vector），轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXC2 過表達(dá)質(zhì)粒，MMP 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05，見圖2B）。

3 討 論

在世界范圍內(nèi)，肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡率的主要原因之一［1］。主要病理類型為NSCLC［2］。盡管針對NSCLC 的治療已經(jīng)有了巨大的進(jìn)步，但其5 年生存率仍然較低［3］。NSCLC 早期診斷較為困難，臨床上確診的NSCLC 病例往往已經(jīng)處于中晚期［3］。因此，急待開發(fā)新的針對NSCLC 的治療靶點(diǎn)。為研究FOXC2 對NSCLC 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們首先通過qRT-PCR 的方法檢測了NSCLC 細(xì)胞系和人支氣管上皮樣細(xì)胞中FOXC2 的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2 在人NSCLC細(xì)胞H1299、A549 中的表達(dá)較人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE 高，提示FOXC2 在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用；繼而，我們以FOXC2 表達(dá)相對較低的A549 細(xì)胞為研究對象，探討FOXC2 對于NSCLC 細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。本研究將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FOXC2 轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，上調(diào)A549 細(xì)胞中FOXC2 的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FOXC2 質(zhì)粒后，A549 細(xì)胞的增殖能力上升；過表達(dá)FOXC2 能夠促進(jìn)A549 細(xì)胞的侵襲遷移能力，提示在NSCLC 細(xì)胞中FOXC2 起促癌的作用。FOXC2 屬于FOX 轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員，作為關(guān)鍵的癌基因，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌、結(jié)直腸癌中高表達(dá)，在NSCLC 中表達(dá)水平同樣異常上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)FOXC2 與乳腺癌EMT相關(guān)，同樣的結(jié)果得到相關(guān)研究的驗(yàn)證，F(xiàn)OXC2 在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，且與侵襲性乳腺癌相關(guān)［6］。另外，有研究表明FOXC2 通過抑制FOXO3a 并激活MAPK/AKT 信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖［7］。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)FOXC2 同樣促進(jìn)了NSCLC 細(xì)胞的侵襲遷移能力。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶家族參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程［8］。腫瘤細(xì)胞合成和分泌MMP 降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。MMP9 是MMPs家族重要成員，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)FOXC2可能通過上調(diào)MMP9 從而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的侵襲遷移。

綜上所述，本研究證實(shí)FOXC2 在NSCLC 細(xì)胞中呈高表達(dá)，過表達(dá)FOXC2 可能通過上調(diào)MMP9的表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的侵襲遷移，為NSCLC 的進(jìn)一步治療提供可能的靶點(diǎn)。