基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜技術(shù)的水稻葉片蛋白絕對(duì)定量方法

陳銘學(xué) 楊歡 曹趙云 馬有寧 曹珍珍 程方民

基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜技術(shù)的水稻葉片蛋白絕對(duì)定量方法

陳銘學(xué)1,2,#楊歡2,#曹趙云2馬有寧2曹珍珍2程方民1,*

(1浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058；2中國水稻研究所，杭州 310006；#共同第一作者；*通信聯(lián)系人，E-mail: chengfm@zju.edu.cn)

【】建立水稻葉片蛋白的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)質(zhì)譜絕對(duì)定量方法。水稻葉片蛋白經(jīng)含1.0%十二烷基硫酸鈉(SDS)的磷酸鹽(PBS)緩沖液提取，丙酮沉淀除雜純化、胰蛋白酶消化，酶解液經(jīng)液相色譜分離，MRM質(zhì)譜監(jiān)測(cè)，外標(biāo)法定量。向提取緩沖液中加入1.0% SDS可增強(qiáng)水稻葉片中16種靶蛋白和總蛋白質(zhì)的提取效果；不同有機(jī)試劑處理，總蛋白質(zhì)沉淀量存在顯著差異(<0.05)，沉淀能力從強(qiáng)到弱依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇；對(duì)于16種目標(biāo)蛋白，總體以丙酮沉淀效果最好，其次是異丙醇和乙腈，甲醇和乙醇效果較差。該方法線性范圍均達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，定量限為0.1~2.5 nmol/L，灌漿期16種水稻葉片蛋白質(zhì)含量為6.0~2818.1 μg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于14%。SDS可顯著提高水稻葉片蛋白提取效果，采用丙酮或乙腈可獲得較好的蛋白沉淀效果，但不同蛋白質(zhì)略有差異。結(jié)合MRM質(zhì)譜監(jiān)測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)水稻葉片蛋白的絕對(duì)定量，方法線性范圍寬、敏度高、重復(fù)性好。

水稻葉片；蛋白質(zhì)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；SOD法；絕對(duì)定量

生物體內(nèi)蛋白質(zhì)豐度的動(dòng)態(tài)變化對(duì)各種生命過程有著重要影響[1]，準(zhǔn)確測(cè)定不同狀態(tài)下復(fù)雜生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量及量的變化，是定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容[2]。近年來，高分辨率、高掃描速度生物質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，推動(dòng)了蛋白絕對(duì)定量技術(shù)的發(fā)展。其中，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)質(zhì)譜具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、線性寬等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[3]，被視為靶向蛋白絕對(duì)定量的重要手段，并已應(yīng)用于特異性生物標(biāo)志物篩的選驗(yàn)證[4-5]、食物過敏源的痕量檢測(cè)[6-7]及植物中重要功能蛋白質(zhì)的定量分析[8]等領(lǐng)域。

盡管MRM質(zhì)譜技術(shù)具有諸多技術(shù)優(yōu)勢(shì)，但研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白提取效果、非蛋白組分干擾等因素均會(huì)嚴(yán)重影響方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性[9]，這給現(xiàn)有的蛋白樣本制備手段帶來巨大挑戰(zhàn)。由于生物基質(zhì)極為復(fù)雜，尤其是植物組織中存在大量蛋白酶、厚壁細(xì)胞和次生代謝化合物(如酚類和色素物質(zhì)等)[10]，嚴(yán)重影響蛋白的提取率和質(zhì)譜分析?，F(xiàn)有的植物蛋白質(zhì)提取方法如酚法、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)-丙酮沉淀法等均存在蛋白質(zhì)提取步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，沉淀后蛋白復(fù)溶不完全等問題[11-12]，難以滿足定量分析的要求。此外，傳統(tǒng)樣品制備過程中的內(nèi)源共提物和外源變性劑等對(duì)質(zhì)譜的離子碎片采集帶來干擾，進(jìn)而對(duì)方法準(zhǔn)確度和精密度造成不利影響[13]。因此，建立高效的蛋白樣品制備方法成為MRM質(zhì)譜蛋白定量技術(shù)的核心內(nèi)容。

水稻(L.)是最重要的糧食作物之一，準(zhǔn)確測(cè)定不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，對(duì)于闡明自身防御系統(tǒng)的分子機(jī)制，增強(qiáng)作物抗逆能力及提高籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)等具有重要意義[8,14]。截至目前，有關(guān)水稻蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量技術(shù)卻鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)特異性肽段的疏水性、等電點(diǎn)、肽段長(zhǎng)度及在色譜中的保留行為等特征，選擇16種典型肽段對(duì)應(yīng)的水稻葉片蛋白為研究對(duì)象[15]，采用表面活性劑輔助沉淀/顆粒酶解(surfactant aided precipitation/on pellet digestion, SOD)蛋白提取、有機(jī)試劑沉淀除雜等系列技術(shù)，建立了適用于水稻葉片蛋白的絕對(duì)定量方法。該方法的建立，將為水稻MRM質(zhì)譜定量蛋白組學(xué)研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

LC-20ADXR 液相色譜儀(日本島津公司)；AB SCIEX QTRAP 5500質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm, 美國Agilent公司)；UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；SD-C18固相萃取小柱(美國3M公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇、丙酮、乙醇和異丙醇(德國Merck公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)殘留試劑盒、20×PBS緩沖液、牛血清蛋白和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海Sangon公司)；乙二胺四乙酸、碳酸氫銨(NH4HCO3，Acros Organics公司)；甲酸(美國Fluka公司)；蔗糖(純度≥99%，阿拉丁試劑有限公司)；SDS、碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、胰蛋白酶、尿素、蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司)；3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽{3-[3-(cholamidopropyl)dimethylamino]propanesulfonic acid inner salt, CHAPS}、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT，Promega公司)，以上試劑均為分析純或色譜純。16種特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)均由上海強(qiáng)耀生物科技公司合成。

1.2 水稻葉片總蛋白質(zhì)樣品制備及酶解

1.2.1 SOD法

供試水稻品種為9311，于2018年5月10日播種并按大田常規(guī)水肥管理，待水稻生長(zhǎng)至灌漿期，取劍葉葉片，剪去中脈后置于?80℃冰箱凍藏。稱取0.5 g經(jīng)液氮研磨后的水稻葉片樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL含1.0% SDS的PBS緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)，冰浴中高速勻漿超聲30 s，于4℃、10 000×條件下離心30 min。取上清液分別加入50 μL 1 mol/L DTT使其終濃度為10 mmol/L，于56 ℃條件下反應(yīng)30 min；加入125 μL 1 mol/L IAA使其終濃度為25 mmol/L，于37 ℃條件下避光孵化30 min。加入等體積(5 mL)的預(yù)冷丙酮混勻，再加入5倍體積的預(yù)冷丙酮?jiǎng)×艺鹗?，置?20 ℃條件下靜置3 h。取出于4 ℃、10 000×離心45 min，棄去上清液。加入等體積的丙酮/水混合液(丙酮∶水=6∶1)清洗沉淀一次，離心30 min后棄去上清液在空氣中自然晾干。用1 mL 50 mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)充分溶解蛋白質(zhì)，于4℃、10 000×條件下離心30 min，取上清液采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。酶解參照Kilambi等[12]的方法。

1.2.2 酚法

參照高歡歡等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.2.3 TCA/丙酮沉淀法

參照Ippoushi等[16]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.3 水稻葉片蛋白質(zhì)酶解液凈化

按Wisniewski等[17]的方法將上述1.2中3種方法獲得的酶解樣品經(jīng)SD-C18柱吸附凈化。具體凈化步驟如下：依次用1 mL甲醇、0.5 mL 70%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)和0.5 mL 0.1%甲酸溶液活化平衡SD-C18固相萃取小柱；將酶解液裝載于小柱中，在4 ℃、300×下離心3 min；加入0.5 mL 0.1%甲酸溶液沖洗小柱后，用0.5 mL 70%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)洗脫，并重復(fù)洗脫一次。將兩次洗脫液混勻過0.22 μm濾膜后上LC-MS/MS分析。

Fig. 1. Total ion chromatogram of 16 kinds of signature peptides.

1.4 儀器采集條件

液相色譜條件：流動(dòng)相分別為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，洗脫梯度為：0~30 min，5%~90% B；30~35 min，90% B；35~35.1 min, 90%~5% B；35.1 ~40 min，5% B。流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI+)；氣簾氣壓力為25 psi；離子源溫度為500 ℃；Gas1和Gas2的壓力均為30 psi；MRM模式采集。

1.5 數(shù)據(jù)分析

QTRAP 5500數(shù)據(jù)分析在Ananlyst 1.6.2軟件處理系統(tǒng)上進(jìn)行。采用SPSS Statistics 19.0軟件(Chicago, Illinois, USA)進(jìn)行對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平為95%(<0.05)，采用OriginPro 8.5(美國OriginLab公司)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRM采集方法的建立

MRM定量蛋白的技術(shù)核心是對(duì)靶標(biāo)蛋白酶解產(chǎn)生的特異性肽段進(jìn)行質(zhì)譜監(jiān)測(cè)，但肽段產(chǎn)生的碎片離子通常比藥物或小分子代謝物更為復(fù)雜，需選擇優(yōu)化合適的離子對(duì)和質(zhì)譜采集參數(shù)[18]。為此，實(shí)驗(yàn)取16種特征肽段的單一母液，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)配制成濃度為100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將該溶液引入質(zhì)譜，利用Skyline軟件對(duì)16種特征肽段的質(zhì)譜參數(shù)(去簇電壓、碰撞池出口電壓和入口電壓)進(jìn)行預(yù)測(cè)和優(yōu)化，并獲得相應(yīng)42組離子對(duì)的MRM采集參數(shù)。

實(shí)驗(yàn)以0.1%甲酸水溶液和乙腈分別為A相和B相，優(yōu)化洗脫梯度。結(jié)果表明，16種特征肽段均在反相色譜柱上獲得較好的保留和良好的分離效果，且單次運(yùn)行時(shí)間小于30 min(16種特征肽段的總離子流見圖1)。通過連續(xù)50次進(jìn)樣發(fā)現(xiàn)，各肽段色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在10%以內(nèi)，保留時(shí)間RSD均小于1.1%。由此說明，該MRM采集方法具有分離效果好、分析速度快、重復(fù)性好等特點(diǎn)，能滿足同時(shí)分析16種目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)要求。

將16種特征肽段單儲(chǔ)備液用5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)配制成5個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度標(biāo)液重復(fù)測(cè)定3次，外標(biāo)法定量。分別以16種特征肽段峰面積()對(duì)質(zhì)量濃度(, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可知，各肽段線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)均大于0.99)，線性范圍均達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)。以信噪比(S/N)分別≥3∶1和≥10∶1計(jì)算得到的濃度表示儀器檢出限(limits of detection, LOD)和定量限(limits of quantification, LOQ)。16種特征肽段的儀器LOD和LOQ范圍分別為0.03~0.8 nmol/L和0.1~2.5 nmol/L，可用于水稻葉片中16種功能蛋白質(zhì)的定量分析。

表1 16種特征肽段的線性方程、相關(guān)系數(shù)及儀器檢出限與定量限

2.2 蛋白質(zhì)SOD提取方法的建立

2.2.1 表面活性劑的選擇

表面活性劑可使內(nèi)源性蛋白質(zhì)酶抑制劑失效，促進(jìn)樣品中蛋白質(zhì)的變性、還原和烷基化，有助于去除影響胰蛋白酶水解和LC-MS分析的小分子雜質(zhì)(如磷脂)[19]。實(shí)驗(yàn)研究了不同SDS濃度(0%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)對(duì)16種目標(biāo)蛋白質(zhì)和總蛋白質(zhì)提取量的影響。結(jié)果(圖2)表明，Q0D5P8等13種目標(biāo)蛋白提取量隨著SDS濃度的增加呈先上升后降低的變化趨勢(shì)，在SDS含量為1.0%或2.0%時(shí)達(dá)到峰值；總蛋白隨著提取液中SDS濃度的增加而提高，但當(dāng)表面活性濃度大于1.0%時(shí)，總蛋白濃度趨于飽和。因此，含1.0%SDS的PBS緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)可獲得較高濃度的蛋白質(zhì)。

此外，我們還考查了其他表面活性劑對(duì)水稻葉片蛋白的提取效果。首先，向PBS提取緩沖液(100 mmol/L, pH 7.4)中加入相同濃度(1.0%)的CHAPS和SDS，并以PBS提取緩沖液為對(duì)照，采用已建立的MRM質(zhì)譜法對(duì)16種目標(biāo)蛋白提取量進(jìn)行比較。結(jié)果表明，使用CHAPS和SDS均有利于促進(jìn)目標(biāo)蛋白的提取，但使用后者的效果更好。其中，使用SDS獲得的12種目標(biāo)蛋白提取濃度顯著高于CHAPS和對(duì)照(<0.05)，增幅分別達(dá)14.2%~80.7%和23.4%~138.6%，其余4種蛋白提取量則無明顯差異。與上述16種目標(biāo)蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，對(duì)3種提取液獲得的總蛋白考查結(jié)果表明，提取液中加入SDS獲得的蛋白總量最高為9.9±0.7 mg/mL，分別較CHAPS和對(duì)照高59.6%和83.3%。上述結(jié)果表明，SDS是促進(jìn)水稻葉片蛋白提取的有效手段。

2.2.2 不同種類有機(jī)試劑的沉淀效果比較

使用有機(jī)試劑不僅可去除粗蛋白中可溶性鹽、脂類、核酸等雜質(zhì)，也能有效去除提取步驟引入的SDS[20]。蛋白質(zhì)的沉淀效果不僅受蛋白質(zhì)種類、分子量的影響，也與沉淀試劑種類密切相關(guān)。因此，實(shí)驗(yàn)考查了乙腈、乙醇、丙酮、甲醇和異丙醇5種有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀效果和SDS的去除作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5種有機(jī)試劑處理，總蛋白質(zhì)沉淀量從高到低依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇(<0.05)。但從圖3可以看出，11種目標(biāo)蛋白采用丙酮沉淀效果最好，少數(shù)(如Q9ZP20、Q0D5P8、Q8H8D6)采用異丙醇或乙腈可獲得最佳沉淀效果。但總體而言，以丙酮效果最好，其次是乙腈和異丙醇，甲醇和乙醇則效果較差。這與不同有機(jī)試劑沉淀總蛋白效果略有差異，說明沉淀試劑對(duì)蛋白沉淀效果具有一定選擇性。

Bereman等[13]研究表明，過高濃度的SDS會(huì)抑制胰蛋白酶活性，干擾RPLC的分離和MS分析。因此，SDS殘留量可作為粗蛋白沉淀除雜的一項(xiàng)重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用上述5種有機(jī)試劑對(duì)SDS的去除率均可達(dá)94.2%以上，均能保證樣品中SDS濃度低于0.01%，符合HPLC和LC/MS分析條件[21]。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇丙酮作為16種目標(biāo)蛋白的沉淀劑。

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異?？v坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)提取百分比，以未加SDS的提取液對(duì)應(yīng)的各目標(biāo)蛋白提取量為100%計(jì)算。

Fig. 2. Influence of different concentrations of SDS in extraction buffer on the extraction effects of 16 kinds of proteins in rice leaves.

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異?？v坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)提取百分比，以乙腈沉淀對(duì)應(yīng)的各目標(biāo)蛋白提取量為100%計(jì)。

Fig. 3. Comparison of precipitation effects of 16 kinds of proteins in rice leaves among five different organic reagents.

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，而具相同字母表示無顯著性差異?？v坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)提取量，以酚法對(duì)應(yīng)的各目標(biāo)蛋白提取量為100%計(jì)。

Fig. 4. Comparison of extraction effects of 16 proteins in rice leaves by SOD, phenol and TCA-acetone precipitation methods.

2.2.3 SOD法與酚法、TCA-丙酮沉淀法比較

將已建立的SOD法與傳統(tǒng)酚法和TCA-丙酮沉淀法對(duì)16種目標(biāo)蛋白質(zhì)和總蛋白的提取效果進(jìn)行比較(圖4)。由圖4可以看出，采用SOD法對(duì)Q40667等9種蛋白的提取量均顯著高于另兩種方法(<0.05)，對(duì)應(yīng)提取量分別比酚法和TCA-丙酮沉淀法高24.7%~96.5%和15.6%~84.7%；TCA-丙酮沉淀法僅對(duì)P12085等4種蛋白質(zhì)的提取量顯著高于SOD法和酚法(<0.05)；相對(duì)而言，酚法的提取效果最差。總蛋白提取量顯示，SOD法提取的總蛋白與酚法無顯著差異，但均顯著高于TCA-丙酮沉淀法(<0.05)。綜合考慮，與酚法和TCA-丙酮沉淀法相比，SOD法更適用于水稻葉片中16種重要功能蛋白質(zhì)定量分析的樣品制備。

2.3 方法應(yīng)用

按上述1.2.1 SOD法重復(fù)制備蛋白質(zhì)樣品(=6)，采用LC-MS/MS和外標(biāo)法測(cè)定16種水稻葉片蛋白含量。結(jié)果如表2所示，灌漿期16種葉片蛋白質(zhì)的含量范圍在6.0~2818.1 μg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在13.9%以下。其中，Q69S39含量最高(2818.1±219.9 μg/g)，該蛋白是位于葉綠體類囊體膜上，參與光合作用的細(xì)胞色素b6-f復(fù)合物重要組分，但還未見對(duì)其絕對(duì)含量的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)所建立的SOD法能有效地提取水稻葉片中蛋白質(zhì)，并結(jié)合MRM質(zhì)譜技術(shù)和外標(biāo)法，實(shí)現(xiàn)水稻灌漿期16種葉片蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量。

表2 SOD法測(cè)定水稻16種葉片蛋白質(zhì)絕對(duì)含量(n=6)

RSD, Relative standard deviation.

3 討論

SDS陰離子變性劑一方面破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)溶解度和酶解，在蛋白質(zhì)(特別是膜蛋白)測(cè)定和蛋白質(zhì)組的全面表征中有所應(yīng)用[22]。另一方面，Ilavenil等[23]研究表明濃度過高(>1.0%)時(shí)也會(huì)抑制胰蛋白酶活性，過量的SDS會(huì)產(chǎn)生DS?，抑制離子電離，影響質(zhì)譜分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)對(duì)提取液中SDS濃度優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDS濃度在1.0%以內(nèi)，16種目標(biāo)蛋白和總蛋白提取量隨濃度增大而增加，但超過1.0%后逐漸趨于飽和甚至呈下降趨勢(shì)。該結(jié)果與An等[19]研究SDS對(duì)血漿中治療蛋白提取效率影響的結(jié)果一致。因此，SDS可作為一種通用技術(shù)，用于生物組織中蛋白質(zhì)的提取。

有機(jī)試劑一方面能降低溶液的電解常數(shù)，導(dǎo)致溶解度下降；另一方面與水作用，破壞蛋白顆粒的水化膜，使大部分蛋白質(zhì)變性聚集沉淀。實(shí)驗(yàn)研究不同種類有機(jī)試劑對(duì)水稻葉片蛋白的沉淀效果發(fā)現(xiàn)，乙腈、甲醇、丙酮等5種有機(jī)試劑對(duì)總蛋白和16種目標(biāo)蛋白沉淀效果存在差異?？偟鞍踪|(zhì)沉淀量從高到低依次為乙腈>丙酮>異丙醇>甲醇>乙醇，但絕大多數(shù)目標(biāo)蛋白則采用丙酮沉淀可獲得最高豐度，少數(shù)(如Q9ZP20、Q0D5P8、Q8H8D6)采用異丙醇或乙腈可獲得最佳沉淀效果。這種現(xiàn)象說明不同沉淀劑對(duì)蛋白質(zhì)具有一定的選擇性。如Ouyang[24]比較多種試劑對(duì)血漿中治療蛋白的沉淀效果發(fā)現(xiàn)，盡管乙腈沉淀可得到最大蛋白濃度，但甲醇沉淀更利于目標(biāo)蛋白后續(xù)復(fù)溶和酶解研究。對(duì)于煙曲霉的分泌蛋白而言，氯仿/甲醇沉淀后能獲得最高的蛋白質(zhì)回收率[25]，但海馬等中藥材中的功能蛋白質(zhì)在丙酮沉淀下能獲得較為全面的蛋白質(zhì)表達(dá)譜[26]。因此，針對(duì)基質(zhì)背景各異和種類特性不同的蛋白質(zhì)，需合理選擇有機(jī)試劑沉淀以達(dá)到高效提取。

此外，丙酮沉淀既能濃縮蛋白，也可以除去粗提液中的可溶性雜質(zhì)，起到純化蛋白的作用。盡管去垢小柱、FASP和MOFs材料等方法被用于去除樣品中殘留的SDS，但存在成本高，操作步驟繁瑣等問題。Santa等[20]采用丙酮沉淀去除提取液中SDS，有效避免殘留SDS對(duì)酶解和定量分析的干擾，提高了蛋白質(zhì)的回收率和重現(xiàn)性。

復(fù)雜組分共存干擾物和待測(cè)蛋白豐度差異大，一直是影響生物體中蛋白準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵因素。盡管人們嘗試多種方法，如提高混合組分分離，去除干擾物等，但對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。MRM質(zhì)譜技術(shù)則通過特征肽段離子對(duì)的選擇性監(jiān)測(cè)，降低了復(fù)雜組分的背景信號(hào)干擾，從而提高了對(duì)低豐度靶標(biāo)蛋白的分析靈敏度，延伸了定量的動(dòng)態(tài)范圍。如Rezeli等[27]采用MRM技術(shù)對(duì)人體血漿中87個(gè)心血管等疾病相關(guān)蛋白標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測(cè)，最大線性動(dòng)態(tài)范圍達(dá)4到5個(gè)數(shù)量級(jí)，定量結(jié)果精密度RSD小于4.7%。此外，Hoofnagle等[28]從方法驗(yàn)證學(xué)上，對(duì)MRM技術(shù)和傳統(tǒng)的免疫分析法進(jìn)行系統(tǒng)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者的分析結(jié)果相關(guān)性達(dá)到0.61~0.96，并提出MRM技術(shù)可作為傳統(tǒng)蛋白定量的替代技術(shù)，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果表明，盡管樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，但16種目標(biāo)蛋白的線性范圍仍超過2個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，雖實(shí)際樣品中各蛋白豐度差異也非常大(各蛋白含量水平為6.0~2818.1 μg/g)，但仍可獲得良好的重復(fù)性，即各蛋白的分析精密度均小于13.9%。

目前基于MRM質(zhì)譜技術(shù)的蛋白定量方法主要應(yīng)用于動(dòng)物組織或細(xì)胞中蛋白標(biāo)志物分析，在植物蛋白組學(xué)研究應(yīng)用較少，其原因主要是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。此外，該技術(shù)需要較高的專業(yè)技能、分析成本等也是阻礙其快速發(fā)展的重要因素。本研究以水稻葉片中相關(guān)蛋白為研究對(duì)象，采用SOD蛋白制備方法和MRM質(zhì)譜分析技術(shù)，建立一種通用的目標(biāo)蛋白絕對(duì)定量技術(shù)流程，以期促進(jìn)該分析技術(shù)在植物蛋白組學(xué)中的推廣和運(yùn)用。

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Absolute Quantification of Proteins in Rice Leaf Based on Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry

CHEN Mingxue1,2,#, YANG Huan2,#, CAO Zhaoyun2, MA Youning2, CAO Zhenzhen2, CHENG Fangmin1,*

(College of Agriculture and Biotechnology,,,;China National Rice Research Institute,,;These authors contributed equally to this work;Corresponding author,:)

【】An absolute quantitative method for proteins in rice leaf based on multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry was established.【】The proteins in rice leaf were extracted with PBS buffer containing 1.0% sodium dodecyl sulfate(SDS), purified by acetone precipitation, and then digested by Trypsin. The enzymatic hydrolysate was separated by liquid chromatography, monitored by MRM mass spectrometry and quantified by external standard method.【】The addition of 1.0% SDS to the extraction buffer enhanced the extraction effect of 16 kinds of target proteins and total proteins in rice leaf. Total proteins precipitation with several solvents varied significantly (<0.05), and the precipitation ability from strong to weak was acetonitrile>acetone>isopropanol>methanol>ethanol. Acetone performed best in the precipitation effect of 16 kinds of target proteins, followed by isopropanol and acetonitrile, and methanol and ethanol represented the worst precipitants. The relative standard deviations of the method were all less than 14% in three orders of magnitude range, with the quantification limit from 0.1 to 2.5 nmol/L, and the contents of 16 kinds of proteins in rice leaf during the grain filling stage ranged from 6.0 to 2818.1 μg/g.【】SDS could significantly improve the extraction effect of proteins in rice leaf. Acetone and acetonitrile addition generated excellent precipitation effects of proteins, with slight difference in various proteins. Combined with MRM mass spectrometry technology, the absolute quantification method for proteins in rice leaf is featured by wide-linear range, high sensitivity and good repeatability.

rice leaf; protein; multiple reaction monitoring; SOD method; absolute quantification

S511.01

A

1001-7216(2020)03-0278-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9056

2019-05-15；

2019-08-01。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31701408）；國家水稻產(chǎn)業(yè)體系資助項(xiàng)目（CARS-01-47）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目（CAAS- ZDRW202011）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（Y2019PT19-01）。