轉(zhuǎn)Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比較轉(zhuǎn)錄組分析

許趙蒙 李利華 高曉慶 袁正杰 李莘 田旭丹 王嵐嵐 瞿紹洪, *

轉(zhuǎn)抗稻瘟病基因水稻株系的比較轉(zhuǎn)錄組分析

許趙蒙1, 2李利華2, 3高曉慶1袁正杰2李莘2田旭丹1, 2王嵐嵐2瞿紹洪2, *

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州 310021；3湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；*通信聯(lián)系人，E-mail: squ@mail.zaas.ac.cn)

【】在轉(zhuǎn)錄水平上解析基因介導(dǎo)的稻瘟病抗性調(diào)控機(jī)理，為培育抗病水稻品種提供理論依據(jù)。向水稻品種日本晴（NPB）及其轉(zhuǎn)抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接種稻瘟菌。分別于接種后0 h、12 h、24 h、36 h提取葉組織樣品，選取12 503個(gè)水稻基因定制基因芯片，進(jìn)行水稻基因轉(zhuǎn)錄組分析，并通過qRT-PCR對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。NPB/Pi9在接種后12 h、24 h和36 h的基因表達(dá)量分別與其接種0 h表達(dá)量比較，共檢測(cè)到7 754個(gè)差異表達(dá)基因；相應(yīng)地，感病水稻NPB在以上時(shí)間點(diǎn)共檢測(cè)到7 385個(gè)差異表達(dá)基因；在接種后36 h，NPB/Pi9的差異表達(dá)基因數(shù)目顯著多于NPB。比較NPB/Pi9和NPB相同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量，共獲得4 065個(gè)差異表達(dá)基因，其中接種后36 h的差異表達(dá)基因顯著多于接種后0 h、12 h或24 h。因此，NPB/Pi9的稻瘟病防御反應(yīng)更強(qiáng)烈。對(duì)NPB/Pi9與NPB相同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析，細(xì)胞外區(qū)域、植物對(duì)刺激應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原、離子結(jié)合、次生代謝和植物激素相關(guān)的GO分類在接種后呈顯著富集，苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和植物激素信號(hào)途徑的KEGG通路在接種后顯著富集。與效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)相關(guān)的水楊酸信號(hào)途徑、幾丁質(zhì)酶，以及與病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)相關(guān)的胞外區(qū)域、對(duì)刺激的應(yīng)答、木質(zhì)素合成等，均在抗感水稻之間差異表達(dá)。而且PTI/ETI共有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信號(hào)途徑等發(fā)生差異表達(dá)。綜上所述，NPB/Pi9和NPB的差異表達(dá)模式與ETI和PTI相關(guān)，兩者相互聯(lián)系并在介導(dǎo)的稻瘟病抗性中發(fā)揮作用。與日本晴比較，抗病基因型NPB/Pi9對(duì)稻瘟病防御反應(yīng)更強(qiáng)烈。轉(zhuǎn)錄因子、激酶、基因、幾丁質(zhì)酶、水楊酸、茉莉酸和乙烯信號(hào)途徑，以及植物次生代謝在介導(dǎo)的稻瘟病抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

水稻稻瘟??；轉(zhuǎn)錄組；抗病基因；植物激素；次生代謝

水稻()是重要糧食作物之一。由水稻稻瘟病菌()引起的稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，是限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素[1]。水稻基因是目前水稻育種中廣泛使用的廣譜抗稻瘟病基因之一[2]。編碼NBS-LRR抗病蛋白[3]。Pi9蛋白與稻瘟病菌無毒效應(yīng)蛋白AVR-Pi9互作從而誘導(dǎo)水稻抗病反應(yīng)[4]?；蚴腔虻闹匾蓡T，在效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity, ETI）即病菌小種特異性抗病反應(yīng)中起重要作用[5]?；蚪閷?dǎo)的ETI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括絲裂原激活的蛋白激酶信號(hào)途徑、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)的基因表達(dá)以及水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)等抗病激素的基因調(diào)控[6]。

宿主基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是植物防御反應(yīng)的中心部分，而闡明基因表達(dá)差異的調(diào)控機(jī)制是理解植物抗病分子基礎(chǔ)的關(guān)鍵[7]。Wei等[8]利用基因芯片技術(shù)研究基因介導(dǎo)的水稻免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在水稻抵抗稻瘟病的過程中發(fā)揮重要作用。Zhang等[9]對(duì)具有稻瘟病部分抗性的-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，解析了介導(dǎo)的水稻防御反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

明確水稻抗病感病基因型的基因表達(dá)差異，是解析抗病機(jī)理和培育抗病品種的基礎(chǔ)。Li等[10]對(duì)水稻抗病品種地谷（含和抗稻瘟病基因）與感病品種麗江新團(tuán)黑谷進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，根據(jù)稻瘟病菌附著胞成熟之前地谷啟動(dòng)防御基因的表達(dá)，鑒定出水稻早期防御中發(fā)揮重要作用的受體激酶基因。Kitony[11]以水稻感病品種CO39及其回交轉(zhuǎn)育抗稻瘟病基因的5個(gè)近等基因系為材料，進(jìn)行抗感基因型比較轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)基因的數(shù)量、功能、共表達(dá)模塊等的差異導(dǎo)致供試水稻品種具有不同稻瘟病抗性水平。Meyers等對(duì)轉(zhuǎn)日本晴水稻株系和未轉(zhuǎn)化日本晴的稻瘟菌接種水稻樣品進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，建立了水稻與稻瘟菌分子互作的MPSS數(shù)據(jù)庫（https://mpss.danforthcenter. org/mpss/rice/）。

本研究以日本晴水稻遺傳背景的轉(zhuǎn)基因抗稻瘟病株系和感病的日本晴為材料，利用基因芯片技術(shù)，對(duì)稻瘟病菌接種水稻樣品進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，并對(duì)部分差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，在轉(zhuǎn)錄水平上解析相關(guān)的抗病調(diào)控機(jī)理，為抗稻瘟病水稻育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料育苗

供試水稻材料為日本晴（NPB）及其轉(zhuǎn)基因抗稻瘟病水稻株系（NPB/Pi9）。挑選籽粒飽滿、無霉斑水稻種子，置于羊皮紙袋，37℃下浸種發(fā)芽5 d后移栽入盆，每盆種植抗感基因型兩種材料各5~8株。在24℃~26℃、14 h光照/10 h黑暗、濕度85%的生長(zhǎng)箱中生長(zhǎng)10 d，用于稻瘟菌接種。

1.2 水稻稻瘟病菌噴霧接種和取樣

水稻稻瘟病菌株KJ201在CM培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)12 d，用0.02%吐溫20孢子洗脫液制備孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度至5×105個(gè)/mL，對(duì)水稻植株進(jìn)行噴霧接種。分別于接種后0 h、12 h、24 h、36 h用無菌剪刀剪取水稻葉片組織，液氮速凍后保存于–80℃超低溫冰箱備用。

1.3 差異基因篩選及GO分類富集分析

從稻瘟菌侵染條件下水稻MPSS和SBS轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(美國丹佛斯植物研究中心和俄亥俄州立大學(xué)，https://mpss.danforthcenter.org/mpss/rice/)一共選取 12 503個(gè)水稻基因，包括、類受體蛋白激酶、E3連接酶、轉(zhuǎn)錄因子、SNARE蛋白、鈣依賴性激酶等抗病相關(guān)基因。委托上海伯豪生物技術(shù)公司定制基因芯片，檢測(cè)抗病基因型NPB/Pi9和感病基因型NPB響應(yīng)稻瘟菌侵染的實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)錄譜。

根據(jù)基因芯片雜交檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算每個(gè)基因接種后0 h的相對(duì)表達(dá)量（記為0 hexp），以及接種后12 h、24 h和36 h的相對(duì)表達(dá)量（分別記為12hexp、24hexp和36hexp）。把每個(gè)水稻材料（NPB/Pi9或NPB）各接種時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量與其接種后0 h的表達(dá)量比較，計(jì)算表達(dá)量比值（12hexp/0hexp、24hexp/0hexp和36hexp/0hexp），以此作為每個(gè)材料的每個(gè)基因隨時(shí)間變化發(fā)生差異表達(dá)的量值。計(jì)算抗感基因型NPB/Pi9與NPB中同一基因在相同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的比值（0hexp-Pi9/0hexp-NPB、12hexp-Pi9/12hexp-NPB、24hexp-Pi9/24hexp-NPB和36hexp-Pi9/36hexp-NPB），作為抗感基因型在相同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異的量值。將表達(dá)量比值不小于2或不大于0.5的基因認(rèn)定為差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。

利用Goatools在線軟件(https://github.com/ tanghaibao/GOatools)對(duì)抗感基因型NPB/Pi9和NPB之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類富集分析。將值小于0.05的GO分類視為顯著富集項(xiàng)。利用KOBAS在線軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對(duì)以上抗感基因型之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，將值小于0.05的KEGG通路定義為顯著富集通路。

1.4 水稻RNA提取及qRT-PCR驗(yàn)證

參照Trizol總RNA提取試劑說明書，從稻瘟病菌侵染的水稻樣品提取總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo公司）檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。參照FastQuant反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TIANGEN公司)進(jìn)行cDNA第1鏈合成。以EF-Tu(Os03g08020)為內(nèi)參基因；使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具（Primer3和Primer-BLAST）設(shè)計(jì)水稻基因RT-PCR引物(表1)；使用SYBR Premix ExⅡ(2x)熒光染料法實(shí)時(shí)定量試劑盒(TaKaRa公司)，ABI PRISM7900?HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（ABI公司）進(jìn)行qRT-PCR。每個(gè)PCR設(shè)置3次重復(fù)。按照2方法定量分析qRT-PCR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟菌誘導(dǎo)水稻基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的分析

根據(jù)12 503個(gè)水稻基因的芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)在接種后12、24和36 h的表達(dá)量分別與其0 h的表達(dá)量比較，共檢測(cè)到7 754個(gè)響應(yīng)稻瘟菌侵染的差異表達(dá)基因，包括4 323個(gè)上調(diào)和3 743個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因（圖1）。感病基因型日本晴（NPB）在接種后12 h、24 h和36 h共有7 385個(gè)差異表達(dá)基因，包括4 153個(gè)上調(diào)和3 588個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因。按照接種時(shí)間進(jìn)程，NPB/Pi9和NPB的差異表達(dá)基因數(shù)目在接種后24 h達(dá)到高峰，在接種后36 h NPB/Pi9的差異表達(dá)基因數(shù)目略有下降，NPB的差異表達(dá)基因數(shù)目則顯著下降（圖2）。

比較抗病基因型NPB/Pi9和感病基因型NPB在相同時(shí)間點(diǎn)（接種后0 h、12 h、24 h或36 h）的基因表達(dá)量，共獲得4 065個(gè)差異表達(dá)基因，其中接種后0 h、12 h、24 h的差異表達(dá)基因數(shù)目較少，接種后36 h的差異表達(dá)基因數(shù)目顯著增加（圖3）。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈差異表達(dá)的差異表達(dá)基因有76個(gè)（圖4），這些差異表達(dá)基因主要編碼蛋白激酶、NBS-LRR抗病蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、E3連接酶等。

Ⅰ和Ⅲ表示上調(diào)表達(dá)基因；Ⅱ和Ⅳ表示下調(diào)表達(dá)基因；N12、N24和N36表示NPB在接種后12 h、24 h和36 h的差異表達(dá)基因數(shù)目；P12、P24和P36表示NPB/Pi9在接種后12 h、24 h和36 h的差異表達(dá)基因數(shù)目。

Fig. 1. Number of differentially expressed genes(DEGs) in NPB/Pi9 and NPB after inoculation.

圖2 NPB/Pi9和NPB在接種后的差異表達(dá)基因數(shù)的變化

Fig. 2. Changes of differentially expressed gene (DEG) number in NPB/Pi9 and NPB after inoculation.

2.2 水稻差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

利用Goatools在線軟件對(duì)抗感水稻相同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)途徑（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function, MF）的GO分類富集分析。細(xì)胞組分GO分析結(jié)果表明，葉綠體或類囊體膜等光合組分的GO分類在接種后0 h及稻瘟病菌侵染的所有時(shí)間點(diǎn)顯著富集；細(xì)胞外區(qū)域GO分類在接種后0 h、24、36 h呈顯著富集（表2）。根據(jù)分子功能GO分析結(jié)果，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性、氧化還原酶活性、離子結(jié)合活性的GO分類在0 h及所有接種時(shí)間點(diǎn)顯著富集。生物學(xué)過程GO分析結(jié)果顯示，植物對(duì)刺激應(yīng)答的GO分類在接種后0 h和12 h顯著富集；光合作用以及次生代謝的GO分類分別在接種后12 h、24 h和36 h呈顯著富集；植物激素相關(guān)的GO分類在接種后24 h和36 h顯著富集。由此推測(cè)，在接種后不同時(shí)間，抗病水稻NPB/Pi9與感病水稻NPB的生物學(xué)途徑、細(xì)胞組分和分子功能相關(guān)基因呈顯著差異表達(dá)。

圖3 不同接種時(shí)間點(diǎn)抗病基因型NPB/Pi9與感病基因型NPB之間的差異表達(dá)基因數(shù)

Fig. 3. Numbers of differentially expressed genes (DEGs) between the resistant genotype NPB/Pi9 and the susceptible genotype NPB after inoculation.

每一種顏色代表一組差異比較，數(shù)字代表不同實(shí)驗(yàn)獨(dú)有或共有的基因數(shù)，重疊區(qū)是代表不同實(shí)驗(yàn)組共有的基因，非重疊區(qū)代表不同差異比較組獨(dú)有的基因。0 h, 12 hpi, 24 hpi和36 hpi分別代表接種后0 h, 12 h, 24 h和36 h.

Fig. 4. Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) between the resistant genotype NPB/Pi9 and the susceptible genotype NPB.

利用KOBAS在線軟件對(duì)抗感水稻的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析。在0 h未見任何KEGG通路呈顯著富集。光合作用途徑的KEGG通路在接種后12 h、24 h和36 h顯著富集；苯丙烷合成途徑KEGG通路在接種后24 h和36 h有顯著富集；苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的KEGG通路在接種后36 h均有顯著富集（表3）。在接種后24 h和36 h，抗感水稻的差異表達(dá)基因中分別有18個(gè)和42個(gè)差異表達(dá)基因參與苯丙烷生物合成；在接種后36 h，抗感水稻分別有30個(gè)差異表達(dá)基因參與苯丙氨酸代謝，9個(gè)差異表達(dá)基因參與類黃酮生物合成，40個(gè)差異表達(dá)基因參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，NPB/Pi9和NPB的次生代謝以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在稻瘟病菌接種水稻之后基因表達(dá)差異顯著。

表2 NPB/Pi9與NPB之間差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果

2.3 NBS-LRR抗病基因、多種激酶和轉(zhuǎn)錄因子參與NPB/Pi9的稻瘟病抗性

根據(jù)GO分類富集分析結(jié)果，在接種后12 h、24 h和36 h，抗感基因型之間多個(gè)RPM1和類抗病基因呈差異表達(dá)（表4）。WAK和DUF26等類受體蛋白激酶，鈣依賴性蛋白激酶，絲裂原活化蛋白激酶，以及WRKY、MYB、bZIP、ERF/AP2、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子在接種后12 h、24 h和36 h呈差異表達(dá)，并且相應(yīng)差異表達(dá)基因的數(shù)目隨接種時(shí)間進(jìn)程而增多。

2.4 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)

根據(jù)抗感基因型差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析結(jié)果，植物激素水楊酸、茉莉酸和乙烯相關(guān)差異基因的分類呈顯著富集。其中，水楊酸生物合成途徑(GO: 0009697)和對(duì)水楊酸的反應(yīng)(GO: 0009751)分別在接種后12 h和36 h有顯著富集，相關(guān)差異基因主要是MYB轉(zhuǎn)錄因子和凝集素樣激酶。

表3 稻瘟病菌接種后NPB/Pi9和NPB之間差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果

值0.05的通路被認(rèn)定為顯著富集。

KEGG pathways with correctedvalue 0.05 are regarded as significantly enriched.

表4 稻瘟菌接種后NPB/Pi9和NPB之間的差異表達(dá)基因中與激酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因

在抗感基因型NPB/Pi9和NPB之間與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因中，6個(gè)編碼ZIM功能域蛋白的基因在接種后36 h下調(diào)表達(dá)，2個(gè)和3個(gè)ZIM基因分別在接種后12 h和24 h下調(diào)表達(dá)。

在抗感基因型之間與乙烯相關(guān)的差異表達(dá)基因中，分別有2個(gè)乙烯相關(guān)基因在接種后12 h和24 h呈差異表達(dá)，9個(gè)乙烯相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、2個(gè)ACC氧化酶基因(Os01g39860、Os09g27820)以及2個(gè)乙烯不敏感基因(Os04g38400和Os07g48630)在接種后36 h呈差異表達(dá)。因此，水楊酸、茉莉酸以及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控NPB/Pi9的稻瘟病抗性。

2.5 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與植物次生代謝途徑相關(guān)

苯丙烷生物合成是植物次生代謝的重要途徑之一，與植保素、木質(zhì)素和酚類物質(zhì)等抗病化合物的合成相關(guān)[12]。根據(jù)KEGG通路富集結(jié)果，抗感基因型NPB/Pi9和NPB的苯丙烷生物合成、類黃酮代謝以及苯丙氨酸代謝相關(guān)基因呈顯著差異表達(dá)，其差異表達(dá)基因主要是過氧化物酶前體。過氧化物酶前體可形成過氧化物酶體，后者可以調(diào)節(jié)活性氧，分解過氧化氫從而提高植物抗病性[13]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是植物次生代謝的關(guān)鍵酶之一[14]。在抗感基因型的差異基因中檢測(cè)到2個(gè)基因(Os05g35290，Os02g41680)顯著上調(diào)表達(dá)，1個(gè)基因(Os04g43800.1)顯著下調(diào)表達(dá)。肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)是木質(zhì)素生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶[15]，苯丙烷生物合成途徑的3個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)。因此，植物次生代謝途徑參與調(diào)控介導(dǎo)的稻瘟病抗性。

2.6 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與幾丁質(zhì)酶、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)

植物幾丁質(zhì)酶是一類病程相關(guān)蛋白，在植物抵抗病原真菌入侵方面具有重要作用[16]。水稻幾丁質(zhì)酶活性通常與廣譜抗病性相關(guān)[17]。在接種后36 h，NPB/Pi9相對(duì)于NPB有3個(gè)幾丁質(zhì)酶（Os04g41620，Os06g51060，Os10g39680）顯著上調(diào)表達(dá)。把NPB/Pi9在接種后24 h和36 h的基因表達(dá)量分別與其0 h的基因表達(dá)量比較，上述3個(gè)幾丁質(zhì)酶和另一幾丁質(zhì)酶(Os08g41100)顯著上調(diào)表達(dá)。

抗感基因型差異表達(dá)基因的富集結(jié)果顯示，硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。在接種后36 h，NPB/Pi9相對(duì)于NPB有4個(gè)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯著下調(diào)。把NPB/Pi9在接種后12 h、24 h、36 h的基因表達(dá)量與其0 h的比較，上述4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和另一硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Os09g06499)顯著下調(diào)。采用來源于NPB/Pi9和NPB的另一批稻瘟病接種樣品，對(duì)部分幾丁質(zhì)酶基因和硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖5)，各基因的表達(dá)趨勢(shì)與其芯片數(shù)據(jù)(表5)基本一致，表明NPB/Pi9的稻瘟病抗性與幾丁質(zhì)酶、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)。

2.7 基因芯片數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證水稻基因芯片檢測(cè)結(jié)果，從另一批稻瘟病接種試驗(yàn)取NPB/Pi9和NPB水稻樣品，從轉(zhuǎn)錄因子、病程相關(guān)基因等不同功能類別挑選差異表達(dá)基因進(jìn)行定量RT-PCR分析。根據(jù)芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)（表6）和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖6），各差異表達(dá)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。相同小寫字母表示處理間差異不顯著(P<0.05)。表6同。

Fig. 5. qRT-PCR analysis of differentially expressed genes conferring chitinase and sulfate transporter after inoculation.

圖6 NPB/Pi9和NPB接種后差異表達(dá)基因相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR分析

Fig. 6. qRT-PCR analysis of relative expression levels of differentially expressed genes at different hours after inoculation in NPB/Pi9 and NPB.

表5 NPB/Pi9和NPB水稻基因型中幾丁質(zhì)酶和硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)

NPB(或NPB/Pi9)的每個(gè)水稻基因在接種后12 h、24 h和36 h的基因表達(dá)量的芯片檢測(cè)量值，分別與該水稻基因型的相同基因在接種0 h的芯片檢測(cè)量值相比，計(jì)算兩個(gè)量值的比值。0hexp, 12hexp, 24hexp, 36hexp分別表示在接種0, 12, 24 和36 h后的基因相對(duì)表達(dá)量。

The gene-chip detection value of each rice gene in NPB or NPB/Pi9 at 12, 24 and 36 h after inoculation, respectively, was compared to that of the same gene in the same rice genotype at 0 h, by calculating the ratio of the value of 12 h (24 h or 36 h) after inoculation to the value of 0 h.

表6 NPB/Pi9和NPB水稻基因型中不同功能類別水稻基因的芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)

3 討論

本研究采用遺傳背景差異較小的抗病水稻與感病水稻進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，NPB/Pi9和NPB的遺傳差異僅在于轉(zhuǎn)基因的有無?；趩位虿町惖乃具z傳材料的比較轉(zhuǎn)錄組研究，更利于解析抗感水稻材料的基因表達(dá)差異，進(jìn)而闡明抗病調(diào)控的分子機(jī)理。

NBS-LRR抗病基因在植物ETI免疫途徑中起重要作用[5]?？共∷綨PB/Pi9與感病水稻NPB有76個(gè)基因在接種后0 h、12 h、24 h和36 h呈差異表達(dá)，其中多個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆诨蚣易濉Ｒ活惖幕蛲ǔ３式M成型表達(dá)[18]，并且0 h和接種后各時(shí)間點(diǎn)抗感水稻的差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分方面均有GO分類顯著富集，由此可以解釋抗感水稻的差異表達(dá)基因在上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈差異表達(dá)。

根據(jù)水稻差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果，在接種后0 h，NPB/Pi9和NPB在生物學(xué)過程（包括對(duì)刺激的應(yīng)答、氧化還原過程、轉(zhuǎn)錄過程），分子功能（包括離子結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性、氧化還原酶活性），細(xì)胞組分（包括細(xì)胞外區(qū)域、葉綠體組分、類囊體膜）方面分別發(fā)生顯著差異表達(dá)，說明在稻瘟菌侵染之前，NPB/Pi9抗病水稻株系的轉(zhuǎn)錄調(diào)控就已發(fā)生顯著改變，這種轉(zhuǎn)錄重編程現(xiàn)象的根源在于轉(zhuǎn)基因的作用。Zhang等[9]對(duì)NPB遺傳背景的水稻基因RNAi抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系和NPB進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，在接種后0 h，檢測(cè)到兩種水稻的多個(gè)抗病相關(guān)基因發(fā)生顯著差異表達(dá)，說明基因抑制表達(dá)導(dǎo)致抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致上述RNAi株系和NPB在接種稻瘟病菌后分別呈抗病和感病表型。

抗感水稻光合作用過程和光合組分的GO分類在接種后12 h、24 h和36 h顯著富集，并且抗感水稻光合作用KEGG通路在接種后12 h、24 h和36 h也顯著富集，所以稻瘟菌接種導(dǎo)致兩種水稻基因型的光合功能相關(guān)基因產(chǎn)生顯著差異表達(dá)。這些可以理解為抗病水稻NPB/Pi9受病菌影響較小，感病水稻NPB因病菌侵染使得其基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。此外，在接種后0 h，抗感水稻的差異表達(dá)基因的GO分類還顯著富集于葉綠體組分和類囊體膜，說明NPB/Pi9和NPB在稻瘟菌侵染之前就已存在光合組分相關(guān)基因的差異表達(dá)。在接種后0 h，NPB/Pi9和NPB之間發(fā)生離子結(jié)合活性、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性等分子功能的差異表達(dá)，可能影響其葉綠體、類囊體膜等細(xì)胞組分的功能，從而導(dǎo)致差異表達(dá)。

細(xì)胞外區(qū)域是水稻與稻瘟菌分子互作的主要場(chǎng)所[19]。在接種后24 h和36 h，抗感水稻的差異表達(dá)基因的GO分類顯著富集在細(xì)胞外區(qū)域，說明稻瘟菌在侵染點(diǎn)與水稻細(xì)胞表面的分子互作異?；钴S。抗感水稻的WAK、DUF26等多個(gè)類受體蛋白激酶在接種12 h、24 h和36 h分別呈顯著差異表達(dá)。這些激酶屬于跨膜蛋白，可能在PTI免疫中起到模式識(shí)別受體（PRR）[20]的作用。此外，在接種后0 h，抗感水稻的差異表達(dá)基因的GO分類也顯著富集在細(xì)胞外區(qū)域，說明在稻瘟病菌侵染之前，就發(fā)生有胞外區(qū)域相關(guān)水稻基因的差異表達(dá)。根據(jù)生物學(xué)過程的GO分類富集結(jié)果，在接種后0 h，抗感水稻差異表達(dá)基因的GO分類在植物對(duì)刺激應(yīng)答有顯著富集。因此，NPB/Pi9和NPB的上述胞外相關(guān)基因、刺激應(yīng)答相關(guān)基因在接種后0 h呈差異表達(dá)的結(jié)果，可以通過NPB/Pi9水稻株系中抗病調(diào)控途徑發(fā)生轉(zhuǎn)錄重編程作用加以解釋。

WRKY、MYB和NAC轉(zhuǎn)錄因子參與水稻對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的反應(yīng)以及抗病分子調(diào)控[21]。在接種后36 h，抗感基因型之間檢測(cè)到25個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生差異表達(dá)，其中顯著上調(diào)。過表達(dá)促進(jìn)水稻植株體內(nèi)茉莉酸積累，增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性[22]。本研究檢測(cè)到負(fù)調(diào)控JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的ZIM功能域蛋白基因，在NPB/Pi9中顯著下調(diào)表達(dá)，說明在稻瘟菌侵染條件下轉(zhuǎn)抗病株系的JA信號(hào)途徑被激活。因此，基因的抗病功能可能與WRKY30的調(diào)控通路相關(guān)。

根據(jù)抗感基因型NPB/Pi9和NPB差異表達(dá)基因的分析結(jié)果，苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮代謝等植物次生代謝途徑參與調(diào)控介導(dǎo)的稻瘟病抗性。在接種后36 h，MYB轉(zhuǎn)錄因子呈顯著差異表達(dá)，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控苯丙烷的生物合成進(jìn)而合成木質(zhì)素、植保素等抗菌物質(zhì)[12]。木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶PAL也發(fā)生差異表達(dá)，表明木質(zhì)素的積累在介導(dǎo)的稻瘟病抗性中具有重要作用。

一類的抗病基因參與ETI免疫途徑[5]。植物R蛋白識(shí)別病菌分泌到植物細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白，激活ETI免疫反應(yīng)，導(dǎo)致基因的激活和抗病激素的合成[19]。在稻瘟菌侵染后期，NPB/Pi9的水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，幾丁質(zhì)酶基因顯著上調(diào)表達(dá)，這些為ETI免疫反應(yīng)的典型結(jié)果。在另一方面，作為水稻與稻瘟菌互作主要場(chǎng)所的細(xì)胞外區(qū)域在接種后0 h，24 h和36 h發(fā)生差異基因GO分類顯著富集，在接種后0 h和12 h發(fā)生植物對(duì)刺激應(yīng)答的GO分類顯著富集，并且WAK、DUF26蛋白激酶等跨膜蛋白在接種后12 h、24 h和36 h分別呈顯著差異表達(dá)，可能參與水稻細(xì)胞和病菌的分子識(shí)別，因此NPB/Pi9和NPB差異表達(dá)還與PTI免疫途徑相關(guān)。研究表明，ETI和PTI共用WRKY等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等下游信號(hào)途徑[23]。NPB/Pi9和NPB的WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信號(hào)途徑在相同時(shí)間點(diǎn)呈差異表達(dá)。綜上所述，抗感基因型的基因差異表達(dá)同時(shí)與ETI免疫途徑和PTI免疫途徑相關(guān)，ETI和PTI相互聯(lián)系并在介導(dǎo)的稻瘟病抗性中發(fā)揮作用。

本研究選取不同功能類別的水稻差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，對(duì)水稻基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的差異表達(dá)趨勢(shì)與相應(yīng)芯片數(shù)據(jù)基本一致。個(gè)別差異表達(dá)基因或個(gè)別接種時(shí)間點(diǎn)的qRT-PCR和芯片數(shù)據(jù)表現(xiàn)不完全一致的結(jié)果，可能源于qRT-PCR和基因芯片實(shí)驗(yàn)條件的波動(dòng)，或由于水稻RNA樣品來源于不同稻瘟病接種試驗(yàn)。

水稻抗稻瘟病基因是水稻雜交育種的重要抗源基因[2]。在轉(zhuǎn)錄水平上解析相關(guān)的水稻與稻瘟菌互作的分子機(jī)制以及水稻抗病調(diào)控途徑，其研究結(jié)果豐富了植物抗病分子基礎(chǔ)，為通過雜交育種方法改良水稻稻瘟病抗性以及通過基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制水稻抗病種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

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Comparative Transcriptome Analysis of Transgenic Rice Line Carrying the Rice Blast Resistance Gene

XU Zhaomeng1, 2, LI Lihua2, 3, GAO Xiaoqing1, YUAN Zhengjie2, LI Xin2, TIAN Xudan1, 2, WANG Lanlan2,QU Shaohong2, *

(1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;3College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;*Corresponding author, E-mail:squ@mail.zaas.ac.cn)

【】The purpose of the study is to analyze the mechanism behindgene-mediated rice blast resistance at the transcriptional level, and to lay a theoretical basis for breeding disease-resistant rice cultivars. 【】Rice cultivar Nipponbare (NPB) and NPB-transgenic line carrying therice blast resistance gene (NPB/Pi9) were inoculated withLeaf tissues were sampled at 0 h, 12 h, 24 h, and 36 h after inoculation, respectively. Gene-chip transcriptome analysis of 12503 rice genes was performed using the rice samples, and the microarray data were verified by qRT-PCR of a set of differentially expressed genes (DEGs). 【】7754 DEGs were identified by comparing the gene expression levels in the resistant NPB/Pi9 line at 12 h, 24 h and 36 h after inoculation, respectively, to that at 0 h after inoculation. Accordingly, 7385 DEGs were identified in the susceptible rice NPB at the same time points. At 36 h after inoculation, the DEG number of NPB/Pi9 was significantly higher than that of NPB. 4065 DEGs were identified by comparing the gene expression levels in NPB/Pi9 and NPB at the same time points; there were significantly more DEGs at 36 h after inoculationthan at 0 h, 12 hor 24 h after inoculation. Therefore, NPB/Pi9 exhibited more intensive defense responses to. Gene Ontology (GO) and KEGG analyses were carried out on the DEGs between NPB/Pi9 and NPB at the same time points. The GO terms classifications related to extracellular regions, plant response to stimuli, transcriptional regulation, redox activity, ion binding activity, secondary metabolism and plant hormones were significantly enriched for the time points post inoculation. The KEGG pathways of phenylalanine metabolism, flavonoid biosynthesis and plant hormone signaling were enriched significantly at the time points post inoculation. Distinctive gene expression patterns were observed between NPB/Pi9 and NPB at the same time points for the genes of the effector-triggered immunity (ETI) related salicylic acid signaling pathway and chitinase, and the PAMP-triggered immunity (PTI) related extracellular regions, response to stimuli, and lignin biosynthesis. Moreover, distinctive gene expression patterns were observed between NPB/Pi9 and NPB at the same time points for the genes of WRKY transcription factors, MAPK kinases, jasmonate and ethylene signaling pathways that were utilized by both PTI and ETI. Based on all the results, the differential expression patterns between NPB/Pi9 and NPB are related to ETI and PTI, which are involved with each other and play important roles in the-mediated rice blast rice resistance. 【】 Compared with NPB, the resistant genotype NPB/Pi9 showed more intensive defense responses against. Transcription factors, kinases,genes, chitinases, salicylic acid-, jasmonic acid-, and ethylene-signaling pathways, and plant secondary metabolism play important roles ingene-mediated rice blast resistance.

rice blast; transcriptome; resistance genes; plant hormones; secondary metabolism

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2020)03-0245-11

10.16819/j.1001-7216.2020.9126

2019-11-23;

2020-03-11。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31272016）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放基金資助項(xiàng)目（2010DS700124-ZZ1906）;浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院扶持學(xué)科建設(shè)2018年B類項(xiàng)目。